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プローブ修飾ナノ粒子を用いた有害微生物の高感度バイオセンシングシステム コモンズ 新技術説明会

国内特許コード P160012921
整理番号 FU534
掲載日 2016年4月19日
出願番号 特願2013-108792
公開番号 特開2014-226093
出願日 平成25年5月23日(2013.5.23)
公開日 平成26年12月8日(2014.12.8)
発明者
  • 末 信一朗
  • 里村 武範
  • 坂元 博昭
出願人
  • 国立大学法人福井大学
発明の名称 プローブ修飾ナノ粒子を用いた有害微生物の高感度バイオセンシングシステム コモンズ 新技術説明会
発明の概要 【課題】従来法に比して迅速かつ簡便な有害微生物の高感度バイオセンシング技術を提供すること。
【解決手段】第1のプローブが表面に担持されておりかつ磁性を有する第1の粒子と、第2のプローブおよび電気化学的活性物質が表面に担持されている金属ナノ粒子からなる第2の粒子とを使用し、標的微生物のDNAを該2つのプローブとハイブリダイズさせて、該DNAを介して第1の粒子および第2の粒子が連結された複合体を形成させる。複合体を磁気的相互作用を利用して回収し、回収した複合体を電気化学測定に供して電気化学的活性物質を検出する。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要


有害微生物による食中毒や感染症は深刻な社会問題となっている。例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)による院内感染が依然として発生している他に、カンピロバクターやサルモネラ属菌による問題がある。そのため、適切な防疫処置を実施するための有害微生物の迅速な検出手段が求められている。



従来の有害微生物に対する検出方法には、培養法、免疫学的手法、遺伝子工学的手法(リアルタイムPCR法等)等がある。いずれの方法も感度は高いものの、長期間の培養や煩雑な操作を必要とするため、迅速な検知は不可能であった。また、リアルタイムPCR法ではコストが高いという問題がある。さらに、検出には大型の装置が必要であるため、携帯性に乏しく「その場」分析も困難である。

産業上の利用分野


本発明は、衛生検査のための有害微生物の検出技術に関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】
検査試料中の標的微生物を検出するための方法であって、
(1)検査試料からDNAを抽出し、かつ抽出したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程、
(2)得られた一本鎖DNAと、標的微生物のDNAの一鎖中の第1の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第1のプローブが表面に担持されておりかつ磁性を有する少なくとも1つの第1の粒子と、該一鎖中の第1の領域とは重複しない第2の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第2のプローブおよび電気化学的活性物質が表面に担持されている非磁性金属ナノ粒子からなる少なくとも1つの第2の粒子とを、該一本鎖DNA中にある第1の領域と第1のプローブとの間、および、該一本鎖DNA中にある第2の領域と第2のプローブとの間のハイブリダイゼーションを許容する条件下において接触させ、それにより該一本鎖DNAを介して第1の粒子と第2の粒子とが連結された複合体を形成させる工程、
(3)磁気的相互作用を介して該複合体を回収する工程、
(4)回収した複合体を電気化学測定に供し、それにより該電気化学的活性物質を検出する工程
を含む、前記方法。

【請求項2】
第1の粒子の平均粒径が100~500nmであり、かつ、第2の粒子の平均粒径が10~100nmである、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
非磁性金属ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
電気化学的活性物質がフェロセンである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】
第1のプローブが20~100塩基のオリゴヌクレオチドであり、かつ、第2のプローブが20~100塩基のオリゴヌクレオチドである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。

【請求項6】
前記(4)の工程が、回収した複合体の存在下、該電気化学的活性物質の酸化電位において酸化酵素による基質の酸化反応を生じさせるか、または、該電気化学的活性物質の還元電位において還元酵素による基質の還元反応を生じさせ、それにより発生した電流を測定することを含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。

【請求項7】
基質がL-プロリンであり、かつ、酸化酵素がL-プロリン脱水素酵素である、請求項6に記載の方法。

【請求項8】
標的微生物が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、カンピロバクター属菌、サルモネラ属菌、腸管出血性大腸菌、ビブリオ属菌、レジオネラ属菌およびセレウス菌からなる群から選択される1以上の微生物である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。

【請求項9】
(1)標的微生物のDNAの一鎖中の第1の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第1のプローブが表面に担持されておりかつ磁性を有する少なくとも1つの第1の粒子と、(2)該一鎖中の第1の領域とは重複しない第2の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第2のプローブおよび電気化学的活性物質が表面に担持されている非磁性金属ナノ粒子からなる少なくとも1つの第2の粒子とを組み合わせてなる、検査試料中の標的微生物の検出用試薬キット。

【請求項10】
第1の粒子の平均粒径が100~500nmであり、かつ、第2の粒子の平均粒径が10~100nmである、請求項9に記載の試薬キット。

【請求項11】
非磁性金属ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項9または10に記載の試薬キット。

【請求項12】
電気化学的活性物質がフェロセンである、請求項9~11のいずれか1項に記載の試薬キット。

【請求項13】
第1のプローブが20~100塩基のオリゴヌクレオチドであり、かつ、第2のプローブが20~100塩基のオリゴヌクレオチドである、請求項9~12のいずれか1項に記載の試薬キット。

【請求項14】
酸化酵素および基質、または、還元酵素および基質を更に含む、請求項9~13のいずれか1項に記載の試薬キット。

【請求項15】
基質がL-プロリンであり、かつ、酸化酵素がL-プロリン脱水素酵素である、請求項14に記載の試薬キット。

【請求項16】
標的微生物が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、カンピロバクター属菌、サルモネラ属菌、腸管出血性大腸菌、ビブリオ属菌、レジオネラ属菌およびセレウス菌からなる群から選択される1以上の微生物である、請求項9~15のいずれか1項に記載の試薬キット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 公開
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