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蛍光染色による芽胞の迅速な検出方法 UPDATE コモンズ 実績あり

国内特許コード P160013033
整理番号 2013-2JP
掲載日 2016年6月3日
出願番号 特願2015-536581
出願日 平成26年9月9日(2014.9.9)
国際出願番号 JP2014073792
国際公開番号 WO2015037578
国際出願日 平成26年9月9日(2014.9.9)
国際公開日 平成27年3月19日(2015.3.19)
優先権データ
  • 特願2013-191121 (2013.9.13) JP
発明者
  • 高松 宏治
  • 桑名 利律子
  • 藤田 康弘
  • 木ノ内 智之
出願人
  • 学校法人常翔学園
発明の名称 蛍光染色による芽胞の迅速な検出方法 UPDATE コモンズ 実績あり
発明の概要 本発明は、芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤で試料を染色して蛍光観察を行うことを特徴とする芽胞を検出する方法等を提供する。
従来技術、競合技術の概要


芽胞(spore)とは、一部の細菌が栄養状態や生育環境が悪化すると形成する極めて耐久性の高い細胞構造であり、芯部(コア)、皮層(コルテックス)、皮層を覆う芽胞殻(スポアコート)から構成される。芽胞を形成する細菌は、栄養細胞が生育に適した環境では分裂・増殖する。一方、栄養状態や生育環境が悪化すると、栄養細胞が不等分裂により母細胞と前芽胞を生じ、前芽胞はエンガルフメントが完了するとフォアスポアとなり、フォアスポアが成熟して芽胞になると母細胞の自己溶解により芽胞が細胞外に放出される。芽胞を形成する菌(以下、芽胞菌または芽胞形成菌という)は、クロストリジウム属のボツリヌス菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、バチルス属の枯草菌、セレウス菌、炭疽菌等が知られている。芽胞は、熱・紫外線・化学薬品等に対して高い抵抗性を示し、栄養源の枯渇した環境下でも長期間休眠状態を維持できるため、食品、医薬品または化粧品等の危害菌として知られている。



食品や飲料に対する消費者ニーズが多様化し、さらにグローバル化により海外での工場生産が拡大する現状において、安全性の高い製品を低コストで供給するためには、芽胞に対する製品管理技術の向上が求められている。



従来、芽胞検出法としては、可視光で観察する芽胞染色法(非特許文献1)や発芽した芽胞を蛍光染色する方法(非特許文献2)等が知られている。例えば、塗抹標本をマラカイトグリーンで染色し芽胞を可視光で観察するWirtz法、塗抹標本をメチレンブルーで染色し芽胞を可視光で観察するMoeller法等である。
しかし、可視光で観察するためには、十分に培養した上で菌体を加熱固定してから染色することが必要となり、培養装置等も必要な上に、培養時間も必要であるため、当該方法は簡便で迅速な検出法とは言い難い。
また前記の方法によって検出可能な芽胞は、発芽芽胞に限られ、休眠中の芽胞は細胞膜やDNAが露出していないために蛍光染色剤を浸透させることは困難である上に、芽胞とそれ以外の細胞を肉眼で正確に区別するには熟練を要し、自動計測も困難であるなど、前記の方法は汎用的な方法でもない。



本発明者らは、芽胞の殺菌処理の効果を確認するために、芽胞を損傷させ、コア内部に存在するDNAを蛍光試薬で染色する方法を開発した(特許文献1)。当該方法は、芽胞菌を培養することなく、各種殺菌処理済の芽胞に対する殺菌若しくは静菌作用を確認することができる優れた方法である。しかし、該方法は芽胞を損傷させる工程等が必要である。
一方、芽胞を損傷処理させることなくチオフラビンTにより、蛍光染色させる方法が開示されている(非特許文献3、4)。該方法は、蛍光染色できることにより芽胞を迅速に検出することができる。しかし、これらの従来知られている方法では、芽胞が蛍光染色されるものの、栄養細胞も同時に染色されるために、芽胞と栄養細胞の識別ができず、芽胞のみを検出することができなかった。
よって、迅速かつ簡便な芽胞検出方法を開発することが望まれている。

産業上の利用分野


本発明は、蛍光染色による芽胞の迅速な検出方法に関する。より詳細には、芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤で試料を染色して蛍光観察を行い、芽胞と栄養細胞とを識別して芽胞のみを迅速に検出する方法等に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
試料中の芽胞を検出する方法において、芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤で試料を染色して蛍光観察を行うことを特徴とする芽胞を検出する方法。

【請求項2】
試料中の芽胞を検出する方法において、芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤で試料を染色し、更に試料を脱色剤で脱色後、蛍光観察を行うことを特徴とする芽胞を検出する方法。

【請求項3】
芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤が、アリザリンレッドS、オーラミンO、オーラミンS、硫酸ベルベリン、カルコフロールホワイト、コンゴーレッド、5-ドデカノイルアミノフルオレセイン、エオシンY、エリスロシンB、エバンスブルー、マラカイトグリーン、ミトトラッカー(商標)グリーンFM、ナイルブルー、パラローズアニリン塩酸塩、フロキシンB、6-プロピオニル-2-ジメチルアミノナフタレン、ピロニンY、ローズベンガル、スルホローダミン101、ユビテックス2B、キシレノールオレンジおよびそれらの塩または遊離体からなる群の少なくとも1種である、請求項1または2に記載の芽胞を検出する方法。

【請求項4】
脱色剤がアルコールである、請求項2または3に記載の芽胞を検出する方法。

【請求項5】
請求項1~4のいずれか1項に記載の蛍光染色剤を含む、芽胞検出キット。

【請求項6】
請求項1~4のいずれか1項に記載の方法で染色された芽胞。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 公開


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