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RNA合成用モノマー、その製造方法、およびRNAの製造方法 新技術説明会

国内特許コード P160013260
整理番号 (774-1343)
掲載日 2016年8月25日
出願番号 特願2014-527019
登録番号 特許第5757641号
出願日 平成25年7月25日(2013.7.25)
登録日 平成27年6月12日(2015.6.12)
国際出願番号 JP2013070247
国際公開番号 WO2014017615
国際出願日 平成25年7月25日(2013.7.25)
国際公開日 平成26年1月30日(2014.1.30)
優先権データ
  • 特願2012-164985 (2012.7.25) JP
発明者
  • 片岡 正典
出願人
  • 国立大学法人高知大学
発明の名称 RNA合成用モノマー、その製造方法、およびRNAの製造方法 新技術説明会
発明の概要 本発明は、効率的に製造され得るものであり、結果としてRNAの製造コストを顕著に低減することができるRNA合成用モノマーと、少ない工程数で効率的にRNA合成用モノマーを製造する方法を提供することを目的とする。また、本発明では、RNA合成用モノマーをほぼ化学量論量で用いる場合であってもRNAを効率的に合成できる方法を提供することも目的とする。本発明に係るRNA合成用モノマーは、下記式(I)または(I’)で表されることを特徴とする。
【化1】



[式中、R1は水酸基の保護基を示し、R2はアルキル基などを示す]
従来技術、競合技術の概要


RNAは、遺伝子の発現において重要な役割を担う他、触媒として機能することも知られている。さらに、mRNAの一部に相補的なRNAを結合させるとmRNAが分解されるRNA干渉という現象が見出されて以来、所望の塩基配列を有するRNAの需要が一層高まっている。



RNAは、複数のリボヌクレオシドが5’位と3’位でホスホジエステル結合している構造を有する。よって、RNAを化学的に合成するに当たっては、2つのリボヌクレオシドを、リン酸を介して5’位と3’位とで選択的に結合することが非常に重要となる。



一般的に、RNAは、塩基部分のアミノ基と2’位の水酸基が保護され且つ3’位で固相担体へ結合しているリボヌクレオシドに、塩基部分のアミノ基と、2’位および5’位の水酸基が保護されたリボヌクレオチドを結合させた後に脱保護する方法で製造される。かかる化学的製造方法では、各水酸基が選択的に保護されたモノマーをいかに効率的に得るかがポイントとなる。以下に、RNA合成用モノマーの代表的な製造方法を示す。



【化1】




上記のとおり、RNA合成用モノマーを製造するには、最短でも7段階もの工程が必要となる。詳しくは、塩基部分のアミノ基は塩基性が高く選択的に保護し易いが、特に2’位と3’位の水酸基の反応性には差がない。よって、3’位と5’位の水酸基を環状保護基で同時に保護した後、2’位水酸基を保護しておき、3’位と5’位の環状保護基を選択的に脱保護する必要があるため、工程数が多くならざるを得ない。



RNA合成の研究は、最後に脱保護すべきものであることから、主に2’位水酸基の保護基に関して行われている。例えば特許文献1には、2’位水酸基が1,3-ジオキソラン-2-イル誘導体基などにより保護されたリボヌクレオシド化合物が開示されている。当該置換基は、安価な試薬により導入可能であり、また、リン酸ジエステル基の転位に対して不活性な酸性条件下で除去可能であるとされている。また、特許文献2には、RNAの3’-5’結合を維持しつつ塩基により除去され得る、2’位水酸基の保護基として、アセトキシメチル基などが記載されている。



また、非特許文献1には、2’位水酸基または3’位水酸基を制御することなくH-ホスホン酸エステル化した後、2’位を選択的にTBDMS(t-ブチルジメチルシリル基)で保護することにより、3’位水酸基がH-ホスホン酸エステル化されたRNA合成用モノマーを得る方法が記載されている。

産業上の利用分野


本発明は、RNA合成用モノマー、当該RNA合成用モノマーを製造するための方法、および、当該RNA合成用モノマーを用いたRNAの製造方法に関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】
下記式(I)で表されることを特徴とするRNA合成用モノマーまたはその塩。
【化1】


[式中、
Bは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンを示し;
1は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、t-ブチルジメチルシリル基、t-ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ-p-キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびt-ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基;トリフェニルメチル基、α-ナフチルジフェニルメチル基、p-メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ(p-メトキシフェニル)フェニルメチル基、トリ(p-メトキシフェニル)メチル基、4-(4’-ブロモフェナシルオキシ)フェニルジフェニルメチル基、4,4’,4”-トリス(4,5-ジクロロフタルイミドフェニル)メチル基、4,4’,4”-トリス(レブリノイルオキシフェニル)メチル基、4,4’,4”-トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル基、3-(イミダゾイル-1-イルメチル)ビス(4’,4”-ジメトキシフェニル)メチル基および1,1-ビス(4-メトキシフェニル)-1’-ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基;または、t-ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し;
2は、C1-4アルキル基、C2-4アルケニル基またはC1-4ハロゲン化アルキル基を示す]

【請求項2】
下記式(I’)で表されることを特徴とするRNA合成用モノマーまたはその塩。
【化2】


[式中、
Bは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンを示し;
1は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、t-ブチルジメチルシリル基、t-ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ-p-キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびt-ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基;トリフェニルメチル基、α-ナフチルジフェニルメチル基、p-メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ(p-メトキシフェニル)フェニルメチル基、トリ(p-メトキシフェニル)メチル基、4-(4’-ブロモフェナシルオキシ)フェニルジフェニルメチル基、4,4’,4”-トリス(4,5-ジクロロフタルイミドフェニル)メチル基、4,4’,4”-トリス(レブリノイルオキシフェニル)メチル基、4,4’,4”-トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル基、3-(イミダゾイル-1-イルメチル)ビス(4’,4”-ジメトキシフェニル)メチル基および1,1-ビス(4-メトキシフェニル)-1’-ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基;または、t-ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し;
2は、C1-4アルキル基、C2-4アルケニル基またはC1-4ハロゲン化アルキル基を示す]

【請求項3】
Bが、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンであって、保護されていないものである請求項1または2に記載のRNA合成用モノマーまたはその塩。

【請求項4】
RNAの液相合成に用いられる請求項1~3のいずれかに記載のRNA合成用モノマーまたはその塩。

【請求項5】
1が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、t-ブチルジメチルシリル基、t-ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ-p-キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびt-ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基を示す請求項1~4のいずれかに記載のRNA合成用モノマーまたはその塩。

【請求項6】
RNA合成用モノマーを製造するための方法であって、
当該RNA合成用モノマーは、下記式(I)の3’-H-ホスホン酸エステル、下記式(I’)の2’-H-ホスホン酸エステルまたはその塩であり;
【化3】


[式中、
Bは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンを示し;
1は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、t-ブチルジメチルシリル基、t-ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ-p-キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびt-ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基;トリフェニルメチル基、α-ナフチルジフェニルメチル基、p-メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ(p-メトキシフェニル)フェニルメチル基、トリ(p-メトキシフェニル)メチル基、4-(4’-ブロモフェナシルオキシ)フェニルジフェニルメチル基、4,4’,4”-トリス(4,5-ジクロロフタルイミドフェニル)メチル基、4,4’,4”-トリス(レブリノイルオキシフェニル)メチル基、4,4’,4”-トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル基、3-(イミダゾイル-1-イルメチル)ビス(4’,4”-ジメトキシフェニル)メチル基および1,1-ビス(4-メトキシフェニル)-1’-ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基;または、t-ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し;
2は、C1-4アルキル基、C2-4アルケニル基またはC1-4ハロゲン化アルキル基を示す]
リパーゼの存在下、H-ホスホン酸エステル化された5’保護リボヌクレオシド(II)と、下記式(III)の化合物:
2C(=O)OR3 ・・・ (III)
[式中、R2は前記と同義を示し;R3は、-H、C1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、-C(=O)R2または-N=C(C1-6アルキル)2を示す]
とを反応させることにより、2’位水酸基または3’位水酸基を選択的にエステル化する工程を含むことを特徴とする製造方法。
【化4】


[式中、R1、R2およびBは上記と同義を示す]

【請求項7】
さらに、5’保護リボヌクレオシド(IV)に三ハロゲン化リンを作用させ、2’位水酸基または3’位水酸基をH-ホスホン酸エステル化することによりH-ホスホン酸エステル化された5’保護リボヌクレオシド(II)を得る工程を含む請求項6に記載の製造方法。
【化5】


[式中、BおよびR1は上記と同義を示す]

【請求項8】
さらに、リボヌクレオシド(V)の5’位水酸基を選択的に保護することにより5’保護リボヌクレオシド(IV)を得る工程を含む請求項7に記載の製造方法。
【化6】


[式中、BおよびR1は上記と同義を示す]

【請求項9】
RNAを製造するための方法であって、
下記式(I)または(I’)で表されることを特徴とするRNA合成用モノマーまたはその塩と
【化7】


[式中、
Bは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンを示し;
1は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、t-ブチルジメチルシリル基、t-ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ-p-キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびt-ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基;トリフェニルメチル基、α-ナフチルジフェニルメチル基、p-メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ(p-メトキシフェニル)フェニルメチル基、トリ(p-メトキシフェニル)メチル基、4-(4’-ブロモフェナシルオキシ)フェニルジフェニルメチル基、4,4’,4”-トリス(4,5-ジクロロフタルイミドフェニル)メチル基、4,4’,4”-トリス(レブリノイルオキシフェニル)メチル基、4,4’,4”-トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル基、3-(イミダゾイル-1-イルメチル)ビス(4’,4”-ジメトキシフェニル)メチル基および1,1-ビス(4-メトキシフェニル)-1’-ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基;または、t-ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し;
2は、C1-4アルキル基、C2-4アルケニル基またはC1-4ハロゲン化アルキル基を示す]
下記式(VI)で表される固定化RNAとを縮合する工程
【化8】


[式中、
Bは上記と同義を示し、且つ、互いに同一であっても異なっていてもよく;
2は上記と同義を示し;
Xは可溶性高分子を示し;
nは整数を示す;
但し、n=0の場合、リン酸ジエステル基は水酸基であるものとする;
また、各リボース単位において、2’位および3’位の置換基は互いに入れ替わっていてもよいものとする];
亜リン酸ジエステル基を酸化する工程;および
1を除去する工程を含むことを特徴とする方法。

【請求項10】
Bが、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンであって、保護されていないものである請求項9に記載の方法。

【請求項11】
上記縮合工程を液相合成で行なう請求項9または10に記載の方法。

【請求項12】
1が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、t-ブチルジメチルシリル基、t-ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ-p-キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびt-ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基を示す請求項9~11のいずれかに記載の方法。

【請求項13】
さらに、リパーゼまたはエステラーゼにより2’位のR2-(C=O)-基と3’位のX-(C=O)-基を除去する工程を含む請求項9~12のいずれかに記載の方法。

【請求項14】
2’位のR2-(C=O)-基と3’位のX-(C=O)-基を除去する工程をC1-4アルコールを含む溶媒中で行う請求項13に記載の方法。

【請求項15】
下記式(XI)で表されることを特徴とするRNAオリゴマーまたはその塩。
【化9】


[式中、
Bは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンを示し、且つ、互いに同一であっても異なっていてもよく;
2は、C1-4アルキル基、C2-4アルケニル基またはC1-4ハロゲン化アルキル基を示し;
4は、水素原子;トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、t-ブチルジメチルシリル基、t-ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ-p-キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびt-ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基;トリフェニルメチル基、α-ナフチルジフェニルメチル基、p-メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ(p-メトキシフェニル)フェニルメチル基、トリ(p-メトキシフェニル)メチル基、4-(4’-ブロモフェナシルオキシ)フェニルジフェニルメチル基、4,4’,4”-トリス(4,5-ジクロロフタルイミドフェニル)メチル基、4,4’,4”-トリス(レブリノイルオキシフェニル)メチル基、4,4’,4”-トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル基、3-(イミダゾイル-1-イルメチル)ビス(4’,4”-ジメトキシフェニル)メチル基および1,1-ビス(4-メトキシフェニル)-1’-ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基;または、t-ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し;
Xは可溶性高分子を示し;
mは1以上の整数を示す;
但し、各リボース単位において、2’位および3’位の置換基は互いに入れ替わっていてもよいものとする]
国際特許分類(IPC)
Fターム
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出願権利状態 登録
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