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血管組織およびその作製方法

国内特許コード P160013390
整理番号 (S2012-1030-N0)
掲載日 2016年10月25日
出願番号 特願2014-531532
出願日 平成25年6月20日(2013.6.20)
国際出願番号 JP2013066993
国際公開番号 WO2014030418
国際出願日 平成25年6月20日(2013.6.20)
国際公開日 平成26年2月27日(2014.2.27)
優先権データ
  • 特願2012-181261 (2012.8.18) JP
発明者
  • 関 実
  • 山田 真澄
  • 岩瀬 優輝
出願人
  • 国立大学法人 千葉大学
発明の名称 血管組織およびその作製方法
発明の概要 少なくとも部分的に細胞によって構成される血管組織を生体外において作製するための既存の手法において必須であった、複雑な位置制御装置および操作、および、多段階にわたる煩雑なプロセスを必要とせず、簡便な操作によって、層状構造、中空構造、分岐構造のすべての構造を兼ね備えた機能的な血管組織を作製する新規手法を提供するとともに、その新規手法によって得られる血管組織を提供する。多価の金属カチオン又は多価の金属カチオンを含む無機塩、を含む素材によって構成される流路構造に対し、細胞を懸濁させた第1のアルギン酸ナトリウム水溶液を導入し、前記流路構造の内壁に細胞を含む第1のアルギン酸ハイドロゲル層を形成した後、前記流路構造内に残存するゲル化していない前記第1のアルギン酸ナトリウム水溶液を除去する、血管組織の作製方法を利用する。
従来技術、競合技術の概要


人工的に構築された血管様の組織や材料は、外科領域における移植用人工血管グラフトとして必須である。また、再生医療を目的として、生体外において比較的大きな組織体を形成するためには、内部の細胞に効率的に酸素や栄養分を供給する必要があり、管腔状の組織を包埋することが望ましい。さらに、生体の構造を模倣した環境において細胞の生理学的評価を行う場合に、血管網を有する組織を作製する必要がある。これらの要求に応えるために、生体外において人工的に機能的な血管組織を作製するための技術開発は、現在世界的にも非常に激しい競争下にある。



このような応用を目的として作製される血管組織は、内部に液体を送液することが可能であること、移植操作などに耐えられる強度を有すること、実際の生体内の組織に比較的近い状態であること、等の条件を満たすことが必要である。



たとえば通常の人工血管としては、一般的にポリエステルやPTFE等の人工材料、あるいはコラーゲンやゼラチン等の生体材料によって形成されたものが用いられるが、直径が5mm程度以下のものは血小板などによって閉塞されやすいため、医療分野において実用化されている人工血管の直径は、通常は5mm以上である。より生体親和性が高く、また血栓の形成を防止できる人工血管として、少なくとも部分的に細胞によって構成された血管組織を利用することが望ましい。



生体内における血管組織は、血管平滑筋細胞の内側に血管内皮細胞が単層状に組織化した多層状構造を形成しており、内部に血液が流通するための中空構造を有し、さらに臓器などの生体組織全体に効率よく栄養素を循環させるために必要に応じて分岐し合流する、といった比較的複雑な組織である。そのため、生体外において機能的な血管組織を作製するためには、これらの構造を簡便かつ正確に再現する手法の開発が必要であり、細胞を3次元的に配置する技術が必要となる。



生体外において細胞によって構成された血管組織を構築するために、これまでに様々な技術が開発されてきた。例として、非特許文献1に示されるような温度応答性培養基材を利用した細胞シートの形成と巻き取り、非特許文献2に示されるようなファイバー状ハイドロゲル材料への細胞の包埋、非特許文献3に示されるような中空状ポリマースキャホ-ルド(細胞培養のための足場となる基材)への細胞の播種、非特許文献4に示されるような細胞集塊を単位構造として利用したインクジェットプリンティングの応用などが挙げられる。

産業上の利用分野


本発明は、血管組織およびその作製方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
多価の金属カチオン又は多価の金属カチオンを含む無機塩を含む素材によって構成される流路構造に対し、
細胞を懸濁させた第1のアルギン酸ナトリウム水溶液を導入し、前記流路構造の内壁に細胞を含む第1のアルギン酸ハイドロゲル層を形成した後、
前記流路構造内に残存するゲル化していない前記第1のアルギン酸ナトリウム水溶液を除去する、血管組織の作製方法。

【請求項2】
ゲル化していない前記第1のアルギン酸ナトリウム水溶液を除去した後、
前記流路構造に、細胞を懸濁させた第2のアルギン酸ナトリウム水溶液を導入し、前記第1のアルギン酸ハイドロゲル層の内壁に、細胞を含む第2のアルギン酸ハイドロゲル層を形成した後、
前記流路構造内に残存するゲル化していない前記第2のアルギン酸ナトリウム水溶液を除去する、請求項1に記載の血管組織の作製方法。

【請求項3】
前記第1のアルギン酸ナトリウム水溶液を除去した後、あるいは前記第2のアルギン酸ナトリウム水溶液を除去した後に、前記流路構造に対し、細胞懸濁液を導入する、請求項1乃至2のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項4】
前記第1のアルギン酸ナトリウム水溶液を導入する直前に、前記流路構造に対し、多価のカチオンを含まない、あるいは多価のカチオン濃度が十分に低い、バッファー水溶液を導入する、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項5】
前記バッファー水溶液は、クエン酸及びエチレンジアミン四酢酸の少なくともいずれかを含む、請求項4に記載の血管組織の作製方法。

【請求項6】
前記第1のアルギン酸ナトリウム水溶液を除去した後、又は、前記第2のアルギン酸ナトリウム水溶液を除去した後に、前記流路構造に対し、多価の金属カチオンを含む水溶液を導入する、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項7】
前記流路構造を構成する素材に対し、物理的操作及び化学的処理の少なくともいずれかを施すことにより、前記流路構造の内壁に形成された前記細胞を含むアルギン酸ハイドロゲル層を前記流路構造から分離し回収する、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項8】
前記流路構造を構成する素材は、少なくとも部分的にハイドロゲル材料である、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項9】
前記ハイドロゲル材料は、アルギン酸、アガロース、ゼラチン、コラーゲン、及び、ポリエチレングリコールジアクリレートの少なくともいずれかを含んで構成されている、請求項8に記載の血管組織の作製方法。

【請求項10】
前記流路構造を構成する素材は、少なくとも部分的にポリジメチルシロキサンである、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項11】
前記多価の金属カチオンとは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、及び、バリウムイオンの少なくともいずれかである請求項1乃至10のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項12】
前記第1のアルギン酸ナトリウム水溶液および前記第2のアルギン酸ナトリウム水溶液に含まれるアルギン酸ナトリウムの濃度は、それぞれ0.1%(w/v)以上10%(w/v)以下である、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項13】
前記流路構造は、その内壁面が予めポリカチオンによって表面処理されている、請求項1乃至12のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項14】
前記ポリカチオンは、ポリ-L-リジン、キトサン、及び、ポリエチレンイミンの少なくともいずれかを含む、請求項13に記載の血管組織の作製方法。

【請求項15】
前記第1のアルギン酸ナトリウム水溶液および前記第2のアルギン酸ナトリウム水溶液のうちの少なくとも一方には、コラーゲン及びマトリゲルの少なくともいずれかが添加されている、請求項1乃至14のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項16】
前記第1のアルギン酸ナトリウム水溶液および前記第2のアルギン酸ナトリウム水溶液のうちの少なくとも一方には、細胞接着性アルギン酸ナトリウムが添加されている、請求項1乃至15のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項17】
前記細胞とは、哺乳動物由来の細胞である、請求項1乃至16のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項18】
前記細胞とは、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、及び血管上皮細胞の少なくともいずれかを含む、請求項1乃至17のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項19】
前記第1のアルギン酸ナトリウム水溶液および前記第2のアルギン酸ナトリウム水溶液に含まれる細胞の密度は、それぞれ1
mL当たり1000万個以上である、請求項1乃至18のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項20】
前記第1のアルギン酸ナトリウム水溶液および前記第2のアルギン酸ナトリウム水溶液に、それぞれ含まれる細胞は、その種類、密度、及び、混合比率のうちの少なくともいずれか1つが異なる、請求項2乃至19のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項21】
前記第1のアルギン酸ハイドロゲル層および前記第2のアルギン酸ハイドロゲル層は、その厚みがそれぞれ10マイクロメートル以上である、請求項1乃至20のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項22】
前記血管組織は、少なくとも部分的に多層状構造、中空構造、および分岐構造を有する、請求項1乃至21のいずれか1項に記載の血管組織の作製方法。

【請求項23】
請求項1乃至22のいずれか一項に記載の血管組織の作製方法を用いて作製された、血管組織。

国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 公開
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