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蛇毒ロドサイチンの機能を保持した遺伝子組換え体の作製方法 NEW

国内特許コード P160013500
整理番号 S2015-0841-N0
掲載日 2016年11月10日
出願番号 特願2015-053625
公開番号 特開2016-171776
出願日 平成27年3月17日(2015.3.17)
公開日 平成28年9月29日(2016.9.29)
発明者
  • 佐々木 知幸
  • 井上 克枝
  • 尾崎 由基男
出願人
  • 国立大学法人山梨大学
発明の名称 蛇毒ロドサイチンの機能を保持した遺伝子組換え体の作製方法 NEW
発明の概要 【課題】
本発明は、血小板活性化能を有するロドサイチンを生産する組換え細胞、その作製方法、および血小板活性化能を有するロドサイチンの製造方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明によれば、血小板活性化能を有するロドサイチンを生産する組換え細胞が提供される。ここで、上記組換え細胞は、前記組換え細胞は、ロドサイチンαサブユニット遺伝子とロドサイチンβサブユニット遺伝子とが導入された組換え細胞である。
【選択図】図1
従来技術、競合技術の概要


ロドサイチン(Rhodocytin)[別名アグレチン(Aggretin)]は、マレーマムシ(Calloselasma rhodostoma)の毒腺から単離された、血小板凝集惹起タンパク質である(非特許文献1)。ロドサイチンは、血小板を凝集し血液を凝固する作用があるため、血小板活性化メカニズムを解明するために多くの研究に用いられている。



血小板は小さな円板状の血球であり、止血作用および創傷の治癒に欠かせないものである。血小板凝集や血液凝固は、コラーゲンなどが血小板表面のレセプターと結合することでシグナル伝達経路が刺激され起こる。
ロドサイチンは、血小板表面のレセプターの一つであるCLEC-2(C-type lectin-like receptor 2)の発見に大きく寄与している(非特許文献2)。
なお、血小板凝集に関連する疾病の治療に役立つ薬剤を開発するためには、血小板表面のレセプターとそのシグナル伝達経路の反応を阻止するのに有効な薬剤の同定を可能とする方法が求められている。そのため、血小板表面のレセプターを同定する必要がある。従って、血小板表面のレセプターと結合するリガンド(ロドサイチン等)の研究は、上記の血小板凝集に関連する疾病の治療に役立つ薬剤を開発するためには必須である。



ロドサイチンは、マレーマムシより単離されたロドサイチンの結晶構造解析によって、ロドサイチンαサブユニットとロドサイチンβサブユニットから構成されるヘテロ四量体の分泌タンパク質である(非特許文献3)。



なお、ロドサイチンαサブユニットとロドサイチンβサブユニットは、独立した遺伝子にコードされており、それぞれ、クローニングされたことが報告されている(非特許文献4)。

産業上の利用分野


本発明は、血小板活性化能を有するロドサイチンを生産する組換え細胞、その作製方法、および血小板活性化能を有するロドサイチンの製造方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
血小板活性化能を有するロドサイチンを生産する組換え細胞であって、
前記組換え細胞は、ロドサイチンαサブユニット遺伝子とロドサイチンβサブユニット遺伝子とが導入された組換え細胞。

【請求項2】
前記ロドサイチンαサブユニット遺伝子は、細胞外分泌が可能なシグナル配列を有し、
前記ロドサイチンβサブユニット遺伝子は、細胞外分泌が可能なシグナル配列を有する、
請求項1に記載の組換え細胞。

【請求項3】
前記組換え細胞は、
第一の組換え体ベクターと、
第二の組換え体ベクターと、を有し、
前記第一の組換え体ベクターは、前記ロドサイチンαサブユニット遺伝子を有し、
前記第二の組換え体ベクターは、前記ロドサイチンβサブユニット遺伝子を有する請求項1または2に記載の組換え細胞。

【請求項4】
前記ロドサイチンαサブユニット遺伝子が、配列番号12に示される塩基配列と
1) 95%以上の配列相同性を有する塩基配列である、または、
2) 1または数塩基が欠失、置換、付加されている塩基配列である、または、
3) 相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列である
請求項1~3のいずれか一つに記載の組換え細胞。

【請求項5】
前記ロドサイチンβサブユニット遺伝子が、配列番号16に示される塩基配列と
1) 95%以上の配列相同性を有する塩基配列である、または、
2) 1または数塩基が欠失、置換、付加されている塩基配列である、または、
3) 相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列である
請求項1~4のいずれか一つに記載の組換え細胞。

【請求項6】
請求項1~5のいずれか一つに記載の組換え細胞から得られるロドサイチン。

【請求項7】
請求項1~5のいずれか一つに記載の組換え細胞を培養する工程と、
血小板活性化能を有するロドサイチンを採取する工程と
を含む、ロドサイチンの製造方法。

【請求項8】
ロドサイチンαサブユニット遺伝子の上流にロドサイチンβサブユニット遺伝子のシグナル配列が導入された組換え体ベクター。

【請求項9】
血小板活性化能を有するロドサイチンを生産する組換え細胞の製造方法であって、
下記の(1)~(2)の遺伝子を宿主細胞に導入し形質転換する工程を含む組換え細胞の製造方法。
(1)ロドサイチンαサブユニット遺伝子
(2)ロドサイチンβサブユニット遺伝子

【請求項10】
前記ロドサイチンαサブユニット遺伝子は、細胞外分泌が可能なシグナル配列を有し、
前記ロドサイチンβサブユニット遺伝子は、細胞外分泌が可能なシグナル配列を有する、
請求項9に記載の組換え細胞の製造方法。

【請求項11】
前記ロドサイチンαサブユニット遺伝子は、第一の組換え体ベクターを含み、
前記ロドサイチンβサブユニット遺伝子は、第二の組換え体ベクターを含む、請求項9または10に記載の組換え細胞の製造方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2015053625thum.jpg
出願権利状態 公開
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