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除去標的DNAの除去方法、DNAカセット、及び発現ベクター NEW コモンズ

国内特許コード P160013533
整理番号 P2015-073224
掲載日 2016年11月29日
出願番号 特願2015-073224
公開番号 特開2016-189761
出願日 平成27年3月31日(2015.3.31)
公開日 平成28年11月10日(2016.11.10)
発明者
  • 房田 直記
出願人
  • 学校法人神奈川大学
発明の名称 除去標的DNAの除去方法、DNAカセット、及び発現ベクター NEW コモンズ
発明の概要 【課題】確実性が高く、かつ、操作性に優れた除去標的DNAの除去方法、このような除去標的DNAの除去方法に適したDNAカセット、及び発現ベクターを提供する。
【解決手段】本発明の除去標的DNAの除去方法は、φK38-1由来の部位特異的組換え酵素により認識される2つの認識配列と、該2つの認識配列に挟まれた除去標的DNAとを含む領域をゲノムDNA中に有する宿主細胞に、前記部位特異的組換え酵素をコードするDNAを有する発現ベクターを導入し、前記宿主細胞内において前記部位特異的組換え酵素を発現させる発現工程を有する。また、本発明の宿主細胞は、好ましくは、細菌細胞であり、細菌細胞のうち、Rubrivivax gelatinosusの細胞がより好ましい。
【選択図】図9
従来技術、競合技術の概要


従来より、宿主細胞のゲノム中の遺伝子破壊や、遺伝挿入を行う際には、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を用いて、遺伝子破壊や遺伝子挿入された宿主細胞を選択する手法が用いられてる。



しかしながら、マーカー遺伝子DNAは、目的の形質転換体を選択した後は不要であり、マーカー遺伝子DNAが残ることにより、形質転換体の操作の妨げとなる場合がある。そこで、形質転換体を得た後に、このマーカー遺伝子DNAを取り除くために、部位特異的組換え酵素を用いることが知られている。



部位特異的組換え酵素は、主に、チロシン型インテグラーゼと、セリン型インテグラーゼの2種類に分類される。



チロシン型インテグラーゼは、組換え反応に宿主側の因子を必要とする、必要とする認識配列が長い等の操作性が低いという問題を有する。



これに対し、セリン型インテグラーゼは、反応に宿主側の因子を必要としない、必要とする認識配列が短い等の、操作性において優れた性質を有することが知られている(例えば、非特許文献1を参照)。

産業上の利用分野


本発明は、除去標的DNAの除去方法、DNAカセット、及び発現ベクターに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
φK38-1由来の部位特異的組換え酵素により認識される2つの認識配列と、該2つの認識配列に挟まれた除去標的DNAとを含む領域をゲノムDNA中に有する宿主細胞に、前記部位特異的組換え酵素をコードするDNAを有する発現ベクターを導入し、前記宿主細胞内において前記部位特異的組換え酵素を発現させる発現工程を有する、除去標的DNAの除去方法。

【請求項2】
前記2つの認識配列のうち、一方が、以下の(a)から(c)のいずれかに記載のDNAであり、他方が、以下の(d)から(f)のいずれかに記載のDNAである、請求項1に記載の除去標的DNAの除去方法。
(a)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNA
(b)配列番号1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(c)配列番号1に記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA
(d)配列番号2に記載の塩基配列を有するDNA
(e)配列番号2に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(f)配列番号2に記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA

【請求項3】
前記発現工程の前に、φK38-1由来の部位特異的組換え酵素により認識される2つの認識配列と、該2つの認識配列に挟まれた除去標的DNAとを含む領域をゲノムDNA中に有する宿主細胞を得る工程を更に有する、請求項1又は2に記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項4】
前記宿主細胞を得る工程は、前記宿主細胞のゲノムDNA中における組換え標的遺伝子DNAと前記領域とを組み換え可能に構築されたターゲティングベクターを前記宿主細胞に導入する工程と、
前記ターゲティングベクターの導入後に、前記宿主細胞のゲノムDNA中における組換え標的遺伝子DNAが前記領域に組み換えられた宿主細胞を選択する第1の選択工程とを含み、
前記除去標的DNAは、第1のマーカー遺伝子DNAであり、
前記ターゲティングベクターは、前記第1のマーカー遺伝子DNAと異なる第2のマーカー遺伝子DNAを有し、
前記第1の選択工程は、前記第1のマーカー遺伝子DNA及び前記第2のマーカー遺伝子DNAを指標として行われる、請求項3に記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項5】
前記第2のマーカー遺伝子DNAは、スクロース致死性遺伝子DNAである、請求項4に記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項6】
前記除去標的DNAは、第1のマーカー遺伝子DNAであり、
前記発現ベクターは、前記第1のマーカー遺伝子DNAと、前記第1のマーカー遺伝子DNAと異なる第3のマーカー遺伝子DNAとを有し、
前記除去標的DNAの除去方法は、前記発現工程後に、前記第1のマーカー遺伝子DNA及び前記第3のマーカー遺伝子DNAを指標として、前記ゲノムDNA中における前記除去標的DNAが除去された前記宿主細胞を選択する第2の選択工程を更に有する、請求項1から5のいずれかに記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項7】
前記宿主細胞は、細菌細胞である、請求項1から6のいずれかに記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項8】
前記細菌細胞は、Rubrivivax gelatinosusの細胞である、請求項7に記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項9】
前記第1のマーカー遺伝子DNAは、カナマイシン耐性遺伝子DNAであり、
前記第3のマーカー遺伝子DNAは、ストレプトマイシン耐性遺伝子DNAである、請求項7又は8に記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項10】
φK38-1由来の部位特異的組換え酵素により認識される2つの認識配列と、該2つの認識配列に挟まれたマーカー遺伝子DNAとを含む領域を有する、DNAカセットであって、
前記2つの認識配列のうち、一方が、以下の(a)から(c)のいずれかに記載のDNAであり、他方が、以下の(d)から(f)のいずれかに記載のDNAである、DNAカセット。
(a)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNA
(b)配列番号1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(c)配列番号1に記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA
(d)配列番号2に記載の塩基配列を有するDNA
(e)配列番号2に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(f)配列番号2に記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA

【請求項11】
前記マーカー遺伝子DNAが、配列番号3に記載の塩基配列を有する、請求項10に記載のDNAカセット。

【請求項12】
φK38-1由来の部位特異的組換え酵素をコードするDNAと、カナマイシン耐性遺伝子DNAと、ストレプトマイシン耐性遺伝子DNAとを有する発現ベクター。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 公開
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