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標的核酸の検出方法 NEW 新技術説明会

国内特許コード P160013576
掲載日 2016年12月28日
出願番号 特願2011-134800
公開番号 特開2013-000060
登録番号 特許第5863162号
出願日 平成23年6月17日(2011.6.17)
公開日 平成25年1月7日(2013.1.7)
登録日 平成28年1月8日(2016.1.8)
発明者
  • 福田 伸治
  • 桑山 勝
  • 重本 直樹
  • 谷澤 由枝
  • 山田 裕子
  • 松尾 健
出願人
  • 広島県
発明の名称 標的核酸の検出方法 NEW 新技術説明会
発明の概要 【課題】少なくとも1種類の標的核酸を同時に増幅させ、目視で識別することができる標的核酸の検出・識別方法を提供することである。
【解決手段】上流側及び/又は下流側プライマーに異なる蛍光物質を標識する工程と、標的核酸の種類ごとに、標的核酸を増幅させる方法に応じた少なくとも1本の前記蛍光標識プライマーを含む標的核酸増幅用のプライマーを添加して、少なくとも1種類の標的核酸を同時に増幅させる工程と、前記増幅させた標的核酸増幅液に、前記蛍光物質を標識したプライマーと相補配列を有しクエンチャーを標識したオリゴヌクレオチドを添加させて反応させる工程と、前記反応後の標的核酸増幅液に定められた波長域の光を照射し、蛍光物質から発せられた蛍光色から増幅した標的核酸を検出・識別する工程と、を含む工程としたことで課題を解決できた。
【選択図】 図1
従来技術、競合技術の概要


近年、患者などの生体などから採取した試料中の核酸を同定するための標的核酸の検出・識別方法に関する技術が開示されている。



例えば、標的核酸に対して、一方の末端が蛍光標識された第一プローブと、他方の末端がクエンチャーで標識された第二プローブとを同時にハイブリダイズさせ蛍光体とクエンチャーの相互作用による消光の様子を観察することにより、試料中に存在する特定の標的核酸量を調べる技術が開示され、蛍光プレートリーダーや蛍光光度計などの機器を使用して蛍光シグナルを測定している技術が開示されている(特許文献1参照。)。



また、PCR容器内に、検出すべき標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した標識プローブを含まない反応液とともにある標的核酸を注入する工程と、該標的核酸反応液の上部に、検出すべき該標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した標識プローブ混合液を注入する工程と、これに蓋をして核酸増幅させる工程と、核酸増幅後に遠心して反応液と標識プローブ混合液とを混合させる工程と、混合後に標識ブローブの分析をする工程とからなる技術が開示され、標的プローブのTm値の分析が融解曲線分析で行われる技術が開示されている(特許文献2参照。)。

産業上の利用分野


本願発明は、すべての生物の細胞に含まれている核酸を迅速に、簡易に、しかも複数の核酸を同時に検出・識別する方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
検出しようする少なくとも1種類の標的核酸の種類ごとに添加する標的核酸増幅用のプライマーに対して検出用の異なる蛍光物質を標識する蛍光物質標識工程と、
標的核酸の種類ごとに、標的核酸を増幅させる方法に応じた前記標的核酸増幅用の、前記蛍光標識されたプライマーを添加して、少なくとも1種類の標的核酸を同時に増幅させる増幅工程と、を備える標的核酸の検出方法において、
前記増幅させた標的核酸増幅液に、前記蛍光物質を標識したプライマーと相補配列を有するクエンチャーを標識したオリゴヌクレオチドを添加させて反応させる反応工程と、前記反応後の標的核酸増幅液にあらかじめ定められた波長域の光を照射し、前記照射により蛍光物質から発せられた蛍光から増幅した標的核酸を検出し、前記蛍光の色から標的核酸を識別する検出・識別工程と、を含む工程からなることを特徴とする標的核酸の検出方法。

【請求項2】
前記プライマーに標識する蛍光物質が、前記プライマー配列の5’末端又は鎖内に標識されることを特徴とする請求項1に記載の標的核酸の検出方法。

【請求項3】
前記オリゴヌクレオチドに標識されたクエンチャーが、前記オリゴヌクレオチドの配列の5’末端、3’末端又は鎖内に標識された、前記蛍光物質から発せられる蛍光を消光する消光物質であることを特徴とする請求項1又は2に記載の標的核酸の検出方法。

【請求項4】
前記照射光の波長域が300~800nmであることを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。

【請求項5】
少なくとも1種類の標的核酸を同時に増幅させる工程が、プライマーを用いて標的核酸を増幅させる方法であればいずれの増幅方法でもよいことを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。

【請求項6】
標的核酸の種類ごとに対応させる上流側及び/又は下流側プライマーそれぞれの5’末端に、標的核酸の種類ごとに異なる蛍光物質を標識させた、同じ配列からなるオリゴヌクレオチドを連結させることを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。

【請求項7】
複数の蛍光物質から発せられた蛍光によって目視で確認できる色が混色となっている場合に、カチオン性ポリマーであるポリエチレンイミンを添加することによって、混色を構成している複数の蛍光物質の中で一部の意図した蛍光物質からの緑色の蛍光色を消光させることを特徴とする請求項1乃至6のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2011134800thum.jpg
出願権利状態 登録


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