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DNA傷害型物質のスクリーニング方法 コモンズ

国内特許コード P170013619
整理番号 OU-0283
掲載日 2017年1月18日
出願番号 特願2014-244935
公開番号 特開2016-106542
登録番号 特許第6187980号
出願日 平成26年12月3日(2014.12.3)
公開日 平成28年6月20日(2016.6.20)
登録日 平成29年8月10日(2017.8.10)
発明者
  • 花田 克浩
  • 山岡 吉生
  • 川島 友莉
  • 西田 欣広
出願人
  • 国立大学法人 大分大学
発明の名称 DNA傷害型物質のスクリーニング方法 コモンズ
発明の概要 【課題】DNA複製が起きている染色体又は核酸上で特異的にDNAを切断する抗癌(腫瘍)活性及び/又は抗ウイルス活性を有する物質を迅速かつ簡便にスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、(1)DNA複製領域を可視化するとともに早期解析を可能にするハロゲン付加ヌクレオチドを取り込ませたDNAを抗体染色する手法と、(2)染色体の切断を見るためのパルスフィールド電気泳動法とを組み合わせることによって、抗癌活性及び/又は抗ウイルス活性を有する物質を特定するスクリーニング方法を提供する。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要


DNAを傷害する化合物は、突然変異や細胞死を引き起こすため有害物質に分類され、DNA合成部位のみに特異的に作用し、かつ、増殖細胞を優先的に傷害する作用がある。このような化合物は抗癌(腫瘍)剤又は抗ウイルス剤としての利用価値がある。特にDNA複製をターゲットにした薬剤は有用性が高い。



しかしながら、抗癌剤の場合、その化学特性に起因して、薬剤が有効に作用する癌細胞種と作用しない癌細胞種が存在することがある。さらに、薬剤による細胞毒性が強すぎるために副作用の1つとして多臓器機能不全を引き起こすことにより、治療を継続できないことも多い。薬効が見られない大きな原因としては、抗癌剤が癌細胞まで届いていないことが想定されている。薬剤による細胞死については、細胞死が癌細胞以外の健常な細胞にも起きることが原因であると考えられる。これらの問題点の解決策として、作用機序が類似なものであっても、化学構造が異なる化合物を見出すことが必要になる。また、既存のすべての薬剤に対して耐性を持った癌が存在することも知られている。したがって、これまでとは異なる作用機序を持った化合物を同定することが重要となる。



また、現在、ウイルス感染、特に、高い罹患率及び死亡率と関連する大規模なウイルス感染に対して、新しい治療薬の開発が必要とされている。これまでに利用可能とされる治療薬は、ウイルス感染の大半の症例に不適切であるかまたは有効ではない。ウイルス感染の治療及び予防を改善するためには、ウイルスのライフサイクルの様々な局面(例えば、DNA複製)を阻害することができる化合物の同定は必要である。



これまでに、本発明者らは、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)を用いて、損傷させたDNA複製フォークにおける修復機構の解明を試みた(非特許文献1及び2)。一方で、このような修復機能を逆に利用して、DNAを損傷させ、複製を阻害する作用機序を持つ抗癌活性や抗ウイルス活性を有する化合物を得る方法は見いだされていない。

産業上の利用分野


本発明は、DNA傷害型物質をスクリーニングする方法に関し、特に抗癌(腫瘍)活性及び/又は抗ウイルス活性を有する物質を得るための新規なスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、該スクリーニング方法によって得られたDNA傷害型物質、及び該DNA傷害型物質を含む医薬組成物に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
DNA傷害型物質をスクリーニングする方法であって、下記:
(a)培養細胞にハロゲン付加ヌクレオチドを添加し、DNAをラベルする工程;
(b)培養系に被験物質を添加する工程;
(c)培養細胞を回収し、溶解後、パルスフィールドゲル電気泳動により染色体又は核酸を分離する工程;
(d)分離された染色体又は核酸をメンブレンに転写し、ハロゲン付加ヌクレオチドに対する一次抗体を添加し、反応させる工程;
(e)標識剤を結合させた、一次抗体に特異的な二次抗体を添加し、反応させる工程;
(f)場合により、該標識剤に対する基質を添加し、反応させる工程;及び
(g)工程(e)又は(f)の反応後、標識剤又は基質に由来するシグナルが検出された場合に、工程(b)において添加された被験物質をDNA傷害型物質として選択する工程を含むスクリーニング方法。

【請求項2】
ハロゲン付加ヌクレオチドが、ブロモデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、フルオロデオキシウリジン、又はクロロデオキシウリジンである、請求項1に記載のスクリーニング方法。

【請求項3】
標識剤が、酵素又は蛍光分子である、請求項1又は2に記載のスクリーニング方法。

【請求項4】
酵素が、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ウレアーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びベータガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項3に記載のスクリーニング方法。

【請求項5】
基質が、5-ブロモ-4-クロロ-3’-インドリルリン酸/ニトロブルーテトラゾリウム(BCIP/NBT)、3,3’‐ジアミノベンジジン四塩酸(DAB)、オルトフェニレンジアミン(OPD)、2,2’-アジノジ(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルフォン酸)、3,3’,5,5’-テトラメチルベンゼン(TMB)、5-アミノサリチルサン(ASA)、ルミノール、及びルシフェリンからなる群から選択される、請求項1~4のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。

【請求項6】
蛍光分子が、Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy-5.5、Cy-7、Alexa、FITC、テキサスレッド、及びローダミンからなる群から選択される、請求項3に記載のスクリーニング方法。

【請求項7】
被験物質が生薬由来の物質から選択される、請求項1~6のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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