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3-ヒドロキシプロリンの分析方法、コラーゲンの測定方法、およびそれに用いる新規Δ1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素 NEW

国内特許コード P170013985
整理番号 (S2013-0983-N0)
掲載日 2017年4月7日
出願番号 特願2015-535349
出願日 平成26年6月5日(2014.6.5)
国際出願番号 JP2014065019
国際公開番号 WO2015033636
国際出願日 平成26年6月5日(2014.6.5)
国際公開日 平成27年3月12日(2015.3.12)
優先権データ
  • 特願2013-186647 (2013.9.9) JP
発明者
  • 渡邉 誠也
  • 谷本 佳彰
出願人
  • 国立大学法人愛媛大学
発明の名称 3-ヒドロキシプロリンの分析方法、コラーゲンの測定方法、およびそれに用いる新規Δ1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素 NEW
発明の概要 簡便な3-ヒドロキシプロリンの分析を可能とする新たな分析方法の提供を目的とする。
下記(s1)~(s3)工程により、被検試料中の3-ヒドロキシプロリンを分析する。
(s1)3-ヒドロキシプロリン脱水酵素により、被検試料中の3―ヒドロキシプロリンをΔ-ピロリン-2-カルボン酸に脱水する脱水工程
(s2)Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素により、前記(s1)工程において得られたΔ-ピロリン-2-カルボン酸を水素化する還元工程
(s3)前記(s2)工程の還元反応を分析する分析工程
従来技術、競合技術の概要


近年、健康および美容の観点から、コラーゲンが注目されており、コラーゲンの定性分析および定量分析が、重要視されている。



試料中のコラーゲンの分析方法としては、コラーゲンに含まれるヒドロキシプロリンの含有量を測定することによって、間接的にコラーゲンを測定する方法が一般的である。コラーゲンは、一般的なタンパク質、すなわち非コラーゲンタンパク質を構成する基本アミノ酸には該当しないヒドロキシプロリンを含有している。このため、試料におけるヒドロキシプロリンを分析すれば、間接的に、前記試料におけるコラーゲンの分析が可能である。そして、ヒドロキシプロリンの測定は、HPLC分析が汎用されている(特許文献1)。具体的な方法としては、まず、試料に前処理を施し、コラーゲンの分解によりヒドロキシプロリンを遊離させる。前処理済みの試料をHPLCに供し、ヒドロキシプロリンのピーク面積からヒドロキシプロリン量を算出する。そして、前記算出値と、コラーゲン1分子あたりのヒドロキシプロリン量とから、前記試料のコラーゲン量を求めることができる。



HPLC分析によりヒドロキシプロリンを分析する場合、ヒドロキシプロリンを、コラーゲンの分解により遊離するL-ヒドロキシプロリンから分離しなければならない。しかしながら、HPLC分析によっても、ヒドロキシプロリンとL-ヒドロキシプロリンとの分離は、困難である。また、ヒドロキシプロリンは2級アミンであることから、特殊な展開溶媒で開環する必要がある。さらに、HPLC分析は、高額な分析カラムおよび機器が必要であり、分析に時間を要するという問題がある。



他方、コラーゲンの中でも、コラーゲンIVは、癌患者の尿中で濃度が上昇することが報告されており、癌のマーカーとなり得る。そして、コラーゲンIVには、他のタイプ(例えば、I~III)と比較して、約8~25倍の3-ヒドロキシプロリンが含まれていることから、3-ヒドロキシプロリンを分析することで、間接的に癌マーカーとなるコラーゲンIVを分析することができる。このため、3-ヒドロキシプロリンの簡便な分析を可能とする方法が求められている。

産業上の利用分野


本発明は、酵素を用いた3-ヒドロキシプロリンの分析方法、コラーゲンの測定方法、およびそれに用いる新規Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
下記(s1)~(s3)工程を含むことを特徴とする、被検試料中の3-ヒドロキシプロリンを分析する分析方法。
(s1)3-ヒドロキシプロリン脱水酵素により、被検試料中の3―ヒドロキシプロリンをΔ-ピロリン-2-カルボン酸に脱水する脱水工程
(s2)Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素により、前記(s1)工程において得られたΔ-ピロリン-2-カルボン酸を水素化する還元工程
(s3)前記(s2)工程の還元反応を分析する分析工程

【請求項2】
前記(s2)工程のΔ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、下記(R1Tl)~(R3Tl)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1記載の分析方法。
(R1Tl) 配列番号14のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2Tl) 前記(R1Tl)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3Tl) 前記(R1Tl)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

【請求項3】
前記(s2)工程のΔ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、下記(R1Ab)~(R3Ab)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1記載の分析方法。
(R1Ab) 配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2Ab) 前記(R1Ab)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3Ab) 前記(R1Ab)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

【請求項4】
前記(s2)工程のΔ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、下記(R1Cp)~(R3Cp)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1記載の分析方法。
(R1Cp) 配列番号13のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2Cp) 前記(R1Cp)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3Cp) 前記(R1Cp)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

【請求項5】
前記(s2)工程のΔ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、下記(R1Ps)~(R3Ps)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1記載の分析方法。
(R1Ps) 配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2Ps) 前記(R1Ps)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3Ps) 前記(R1Ps)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

【請求項6】
前記(s1)工程の3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記(D1Tl)~(D3Tl)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1から5のいずれか一項に記載の分析方法。
(D1Tl) 配列番号12のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2Tl) 前記(D1Tl)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3Tl) 前記(D1Tl)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

【請求項7】
前記(s1)工程の3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記(D1Ab)~(D3Ab)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1から5のいずれか一項に記載の分析方法。
(D1Ab) 配列番号11のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2Ab) 前記(D1Ab)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3Ab) 前記(D1Ab)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

【請求項8】
前記(s1)工程の3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記(D1Cp)~(D3Cp)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1から5のいずれか一項に記載の分析方法。
(D1Cp) 配列番号9のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2Cp) 前記(D1Cp)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3Cp) 前記(D1Cp)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

【請求項9】
前記(s1)工程の3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記(D1Hs)~(D3Hs)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1から5のいずれか一項に記載の分析方法。
(D1Hs) 配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2Hs) 前記(D1Hs)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3Hs) 前記(D1Hs)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

【請求項10】
下記(S1)~(S3)工程を含むことを特徴とする、被検試料中のコラーゲンの測定方法。
(S1)被検試料中のコラーゲンから、3-ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程
(S2)前記(S1)工程で遊離した3-ヒドロキシプロリンの量を、請求項1から9のいずれか一項に記載の分析方法により測定する測定工程
(S3)予め求めた前記コラーゲンに対する3-ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記(S2)工程で測定した3-ヒドロキシプロリンの量からコラーゲンの量を算出する算出工程

【請求項11】
前記コラーゲンが、コラーゲンIVである、請求項10記載の測定方法。

【請求項12】
下記(R1Tl)~(R3Tl)からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、新規タンパク質。
(R1Tl) 配列番号14のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2Tl) 前記(R1Tl)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3Tl) 前記(R1Tl)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

【請求項13】
下記(R1Ab)~(R3Ab)からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、新規タンパク質。
(R1Ab) 配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2Ab) 前記(R1Ab)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3Ab) 前記(R1Ab)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

【請求項14】
下記(R1Cp)~(R3Cp)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素。
(R1Cp) 配列番号13のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2Cp) 前記(R1Cp)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3Cp) 前記(R1Cp)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

【請求項15】
下記(D1Tl)~(D3Tl)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素。
(D1Tl) 配列番号12のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2Tl) 前記(D1Tl)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3Tl) 前記(D1Tl)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

【請求項16】
下記(D1Ab)~(D3Ab)からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、新規タンパク質。
(D1Ab) 配列番号11のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2Ab) 前記(D1Ab)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3Ab) 前記(D1Ab)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

【請求項17】
下記(D1Cp)~(D3Cp)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素。
(D1Cp) 配列番号9のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2Cp) 前記(D1Cp)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3Cp) 前記(D1Cp)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

【請求項18】
3-ヒドロキシプロリンの分析試薬であって、
3-ヒドロキシプロリン脱水酵素およびΔ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素を含むことを特徴とする、分析試薬。

【請求項19】
前記Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、請求項12記載のタンパク質である、請求項18記載の分析試薬。

【請求項20】
前記Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、請求項13記載のタンパク質である、請求項18記載の分析試薬。

【請求項21】
前記Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、請求項14記載のΔ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素である、請求項18記載の分析試薬。

【請求項22】
前記Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、下記(R1Ps)~(R3Ps)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項18記載の分析試薬。
(R1Ps) 配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2Ps) 前記(R1Ps)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3Ps) 前記(R1Ps)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

【請求項23】
前記3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項15記載の3-ヒドロキシプロリン脱水酵素である、請求項18から22のいずれか一項に記載の分析試薬。

【請求項24】
前記3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項16記載のタンパク質である、請求項18から22のいずれか一項に記載の分析試薬。

【請求項25】
前記3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項17記載の3-ヒドロキシプロリン脱水酵素である、請求項18から22のいずれか一項に記載の分析試薬。

【請求項26】
前記3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記(D1Hs)~(D3Hs)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項18から22のいずれか一項に記載の分析試薬。
(D1Hs) 配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2Hs) 前記(D1Hs)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3Hs) 前記(D1Hs)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

【請求項27】
コラーゲンの測定試薬であって、
請求項18から26のいずれか一項に記載の3-ヒドロキシプロリンの分析試薬を含むことを特徴とする、測定試薬。

【請求項28】
下記(r1Tl)~(r3Tl)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素遺伝子。
(r1Tl)配列番号16の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(r2Tl)前記(r1Tl)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(r3Tl)前記(r1Tl)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

【請求項29】
下記(r1Ab)~(r3Ab)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、新規遺伝子。
(r1Ab)配列番号4の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(r2Ab)前記(r1Ab)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(r3Ab)前記(r1Ab)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

【請求項30】
下記(r1Cp)~(r3Cp)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素遺伝子。
(r1Cp)配列番号15の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(r2Cp)前記(r1Cp)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(r3Cp)前記(r1Cp)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

【請求項31】
下記(d1Tl)~(d3Tl)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子。
(d1Tl)配列番号19の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d2Tl)前記(d1Tl)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d3Tl)前記(d1Tl)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

【請求項32】
下記(d1Ab)~(d3Ab)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、新規遺伝子。
(d1Ab)配列番号17の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d2Ab)前記(d1Ab)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d3Ab)前記(d1Ab)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

【請求項33】
下記(d1Cp)~(d3Cp)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子。
(d1Cp)配列番号18の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d2Cp)前記(d1Cp)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d3Cp)前記(d1Cp)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
国際特許分類(IPC)
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