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被毛微生物 NEW

国内特許コード P170014026
整理番号 (S2013-1417-N0)
掲載日 2017年4月10日
出願番号 特願2015-534325
出願日 平成26年8月29日(2014.8.29)
国際出願番号 JP2014072735
国際公開番号 WO2015030171
国際出願日 平成26年8月29日(2014.8.29)
国際公開日 平成27年3月5日(2015.3.5)
優先権データ
  • 特願2013-179948 (2013.8.30) JP
発明者
  • 堀 克敏
出願人
  • 国立大学法人名古屋大学
発明の名称 被毛微生物 NEW
発明の概要 三量体オートトランスポーターアドヘシンに接着又は凝集以外の機能を持たせることを課題とする。三量体オートトランスポーターアドヘシン又はその一部にペプチド又は蛋白質からなる機能分子が結合又は融合してなる機能性ファイバーを細胞表面に発現した微生物が提供される。
従来技術、競合技術の概要


本発明者が以前にバイオフィルターから単離したAcinetobacter sp. Tol 5(アシネトバクター属細菌Tol 5株)は、細胞自己凝集性が高く、また、疎水性の各種プラスチック担体から親水性のガラス、金属表面まで、様々な材料表面に対して高い付着性を示す非病原性のグラム陰性細菌である。他の微生物では報告例のないこのような付着特性をもたらす因子として、細菌細胞表層に存在する新規のバクテリオナノファイバーを発見し、さらにナノファイバーを構成する新しい蛋白質を同定した。この蛋白質は三量体オートトランスポーターアドヘシン(TAA)ファミリーに属しており、本発明者がAtaAと名付けた(非特許文献1)。TAAは種々のグラム陰性病原性細菌が宿主の細胞やコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンといった細胞外マトリックスに特異的に接着し、宿主に感染するために有する病原性因子として知られている(非特許文献2)。TAAファミリーに属する蛋白質はホモ三量体を形成し、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、シグナルペプチド-ヘッド-ネック-ストーク-メンブレンアンカーという共通の基本構造をとる。メンブレンアンカードメインはトランスロケータードメインともいい、外膜にベータバレルを形成し、ペリプラズムでシグナルペプチドが切断された後のヘッド-ネック-ストークから成るパッセンジャードメインを細胞外に輸送、ファイバーとして細胞表層に提示させる機能を有する。パッセンジャードメインのヘッド側がファイバーの先端になり、成熟蛋白質のアミノ末端側にあたる。しかしTAAには、シングルペプチド鎖のアミノ酸残基数が300ほどの小さなものから3000を超える大きなものまで存在し、アミノ酸配列、特にパッセンジャードメインを構成するドメインやモチーフの種類と並びは多様である。本発明者が見つけたAtaAのペプチド鎖は3630アミノ酸から成り、TAAの中でも最大級である。長いストークに複数の長い繰返し配列がモザイク状に並ぶユニークな一次構造をしている。この繰返し配列は、何種類ものモチーフが反復、混在して形成されている。ヘッドもファイバーの先端以外にストークの途中、メンブレンアンカー寄りにもう一つ繰り返す。そして、AtaAのみが様々な表面に対し非特異的で高い接着性を示す。また、TAAの研究は病原性細菌に集中しており、Tol 5のような非病原性細菌についてのTAAの研究例は皆無である。以上の研究成果に基づき、本発明者は、AtaAをコードする遺伝子を導入することによって標的微生物に非特異的付着性及び/又は凝集性を付与又は増強する方法を報告した(特許文献1)。尚、特許文献1ではAtaA及びそれをコードする遺伝子(ataA遺伝子)をそれぞれAadA及びaadA遺伝子と呼称していた。

産業上の利用分野


本発明は機能性ファイバーを細胞表面に発現する微生物及びその作製方法等に関する。本出願は、2013年8月30日に出願された日本国特許出願第2013-179948号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。

特許請求の範囲 【請求項1】
三量体オートトランスポーターアドヘシン又はその一部にペプチド又は蛋白質からなる機能分子が挿入、結合又は融合してなる機能性ファイバーを細胞表面に発現した微生物。

【請求項2】
前記三量体オートトランスポーターアドヘシンが、アシネトバクター属微生物の三量体オートトランスポーターアドヘシンである、請求項1に記載の微生物。

【請求項3】
前記三量体オートトランスポーターアドヘシンが、アシネトバクターsp. Tol5株のAtaAである、請求項1に記載の微生物。

【請求項4】
前記微生物がグラム陰性菌である、請求項1~3のいずれか一項に記載の微生物。

【請求項5】
前記微生物がガンマプロテオバクテリアである、請求項1~3のいずれか一項に記載の微生物。

【請求項6】
前記微生物がアシネトバクター又は大腸菌である、請求項1~3のいずれか一項に記載の微生物。

【請求項7】
前記機能分子が、タグ分子、酵素認識配列、酵素、蛍光蛋白質、抗原、電子伝達系蛋白質及び受容体蛋白質からなる群より選択される一又は二以上の機能分子である、請求項1~6のいずれか一項に記載の微生物。

【請求項8】
前記機能分子が、Hisタグ、FLAGタグ、ソルターゼ認識配列、HRV 3C認識配列、β-グルコシダーゼ又は緑色蛍光蛋白質である、請求項1~6のいずれか一項に記載の微生物。

【請求項9】
前記機能分子が、プロテアーゼ認識配列、或いは、タグ分子、酵素認識配列、酵素、蛍光蛋白質、抗原、電子伝達系蛋白質及び受容体蛋白質からなる群より選択される一又は二以上の機能分子とプロテーゼ認識配列の組合せ、からなる、請求項1~6のいずれか一項に記載の微生物。

【請求項10】
前記機能分子が、Hisタグ、FLAGタグ、ソルターゼ認識配列、HRV 3C認識配列、β-グルコシダーゼ又は緑色蛍光蛋白質である請求項9に記載の微生物。

【請求項11】
三量体オートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAに、ペプチド又は蛋白質からなる機能分子をコードするDNAが挿入又は付加されてなる機能性ファイバーDNAを、標的微生物に導入するステップ、を含む、機能性ファイバーを細胞表面に発現した微生物の作製方法。

【請求項12】
三量体オートトランスポーターアドヘシンをコードする前記DNAが、アシネトバクター属微生物の三量体オートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAである、請求項11に記載の作製方法。

【請求項13】
三量体オートトランスポーターアドヘシンをコードする前記DNAが、アシネトバクターsp. Tol5株のAtaAをコードするDNAである、請求項11に記載の作製方法。

【請求項14】
アシネトバクターsp. Tol5株のAtaAをコードする前記DNAが、以下の(a)~(d)のいずれかのDNAである、請求項13に記載の作製方法:
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるDNA、
(b)配列番号1で表される塩基配列からなるDNAと70%以上の相同性を有する塩基配列からなり、細胞外に分泌されてファイバー構造物を形成する蛋白質をコードするDNA、
(c)配列番号1で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、細胞外に分泌されてファイバー構造物を形成する蛋白質をコードするDNA、
(d)配列番号1で表される塩基配列のシグナルペプチドに相当する部位(1~177位)を残し、その後ろからヘッドドメインのコード領域直前(323位)の間(即ち、178位から323位の間)、より好ましくは310位までの間(即ち、178位から310位までの間)から連続する数百から数千塩基を削った塩基配列からなるDNA。

【請求項15】
前記機能的ファイバーDNAと一緒に、以下の(A)~(C)のいずれかのDNAも前記標的微生物に導入する、請求項12~14のいずれか一項に記載の作製方法:
(A)配列番号3で表される塩基配列からなるDNA、
(B)配列番号3で表される塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA、
(C)配列番号3で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。

【請求項16】
前記機能分子が、タグ分子、酵素認識配列、酵素、蛍光蛋白質、抗原、電子伝達系蛋白質及び受容体蛋白質からなる群より選択される一又は二以上の機能分子である、請求項11~15のいずれか一項に記載の作製方法。

【請求項17】
前記機能分子が、Hisタグ、FLAGタグ、ソルターゼ認識配列、HRV 3C認識配列、β-グルコシダーゼ又は緑色蛍光蛋白質である、請求項11~15のいずれか一項に記載の作製方法。

【請求項18】
前記標的微生物がグラム陰性菌である、請求項11~17のいずれか一項に記載の作製方法。

【請求項19】
前記標的微生物がガンマプロテオバクテリアである、請求項11~17のいずれか一項に記載の作製方法。

【請求項20】
前記標的微生物がアシネトバクター又は大腸菌である請求項11~17のいずれか一項に記載の作製方法。

【請求項21】
請求項11~20のいずれか一項に記載の作製方法で得られた、機能性ファイバーを細胞表面に発現した微生物。

【請求項22】
請求項9、10又は21に記載の微生物から回収された、機能性ファイバー。

【請求項23】
以下のステップ(1)及び(2)を含む、機能性ファイバーの回収方法:
(1)請求項9、10又は21に記載の微生物に対して、前記プロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを作用させるステップ、
(2)切断された機能性ファイバーを回収するステップ。
国際特許分類(IPC)
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出願権利状態 公開
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