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カルジオリピンの定量方法及び定量用キット

国内特許コード P170014102
整理番号 (S2014-0724-N0)
掲載日 2017年5月9日
出願番号 特願2016-511518
出願日 平成27年3月17日(2015.3.17)
国際出願番号 JP2015057870
国際公開番号 WO2015151801
国際出願日 平成27年3月17日(2015.3.17)
国際公開日 平成27年10月8日(2015.10.8)
優先権データ
  • 特願2014-077076 (2014.4.3) JP
発明者
  • 森田 真也
出願人
  • 国立大学法人滋賀医科大学
発明の名称 カルジオリピンの定量方法及び定量用キット
発明の概要 開示されているのは、以下の工程を有する試料中のカルジオリピンの定量方法:(1)試料にホスホリパーゼD、グリセロールキナーゼ、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを作用させる工程、並びに(2)工程(1)で生成する化合物の蛍光強度、吸光度又は発光量を測定し、予め求めた検量線からカルジオリピンを定量する工程、並びにホスホリパーゼD、グリセロールキナーゼ、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを含むカルジオリピンの定量用キットである。
従来技術、競合技術の概要


カルジオリピン(cardiolipin) (以下、CLと称することもある)は、リン脂質の一種であって、動物、植物、細菌界に広く分布し、動、植物では全リン脂質の1~15%、細菌によっては全リン脂質の50%を占める場合もある。また、カルジオリピンは、以下の構造を有している。



【化1】




CLは、哺乳類細胞において主にミトコンドリアに存在しているリン脂質である。このため、CLは、電子伝達系を含むミトコンドリアに存在する様々な酵素活性を調節し、アポトーシスにも関与している。特に、心筋細胞には多量のCLが含まれる。



従来、CLの定量は、薄層クロマトグラフィー/リン定量法により行われてきた。しかしながら、これらの定量法は、検出感度及び定量精度が低く、時間及び手間を必要とした。また、CLに対する質量分析法は確立していない。



このように、CLは生体において重要で欠かすことのできない成分であるにもかかわらず、その分析法は現在においても極めて乏しい。



本発明者は、これまでに一連のリン脂質(ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、及びスフィンゴミエリン)に対する酵素蛍光定量法を開発している(特許文献1、2等)。



特許文献1では、ホスホリパーゼD、L-アミノ酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを試料に作用させて、生成する化合物の蛍光強度を測定することによるホスファチジルセリンの酵素定量法が報告されている。



また、特許文献2では、スフィンゴミエリナーゼ、アルカリホスファターゼ、コリンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを試料に作用させて、生成する化合物の蛍光強度を測定することによるスフィンゴミエリンの酵素定量法が報告されている。



しかしながら、CLについての酵素蛍光定量法については開発されていないため、CLが抜け落ちることにより、リン脂質全体のプロファイルが分からないことが問題となっている。

産業上の利用分野


本発明は、カルジオリピンの定量方法、及びカルジオリピンの定量用キットに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下の工程を有する試料中のカルジオリピンの定量方法:
(1)試料にホスホリパーゼD、グリセロールキナーゼ、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを作用させる工程、並びに
(2)工程(1)で生成する化合物の蛍光強度、吸光度又は発光量を測定し、予め求めた検量線からカルジオリピンを定量する工程。

【請求項2】
前記工程(1)において、(a)ホスホリパーゼDを作用させる段階、並びに(b)グリセロールキナーゼ、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを作用させる段階、の二段階に分けて酵素を作用させる、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
前記ホスホリパーゼDが、ストレプトマイセス属に属する微生物由来のものである、請求項1に記載の方法。

【請求項4】
前記ホスホリパーゼDが、ストレプトマイセス・クロモフスカスに属する微生物由来のものである、請求項1に記載の方法。

【請求項5】
ホスホリパーゼD、グリセロールキナーゼ、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを含むカルジオリピンの定量用キット。

【請求項6】
前記ホスホリパーゼDが、ストレプトマイセス属に属する微生物由来のものである、請求項5に記載のキット。

【請求項7】
前記ホスホリパーゼDが、ストレプトマイセス・クロモフスカスに属する微生物由来のものである、請求項5に記載のキット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 公開


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