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(In Japanese)組織透明化方法、組織透明化試薬及び組織観察方法

Patent code P170014579
File No. AF13-04WO
Posted date Sep 12, 2017
Application number P2014-558293
Date of filing Nov 20, 2013
International application number JP2013006811
International publication number WO2014115206
Date of international filing Nov 20, 2013
Date of international publication Jul 31, 2014
Priority data
  • PCT/JP2013/004369 (Jul 17, 2013) JP
  • P2013-012889 (Jan 28, 2013) JP
Inventor
  • (In Japanese)小野寺 宏
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title (In Japanese)組織透明化方法、組織透明化試薬及び組織観察方法
Abstract (In Japanese)有毒なあるいは危険な有機溶媒を用いることなく簡便な操作によって、種々の臓器をその変化を引き起こすことなく十分に透明化できる技術として、2,2´-チオジエタノールと、グリセロール及び非イオン性有機ヨウ素化合物の少なくとも一方と、を含む水溶性溶媒中に組織を浸漬する手順を含む組織透明化方法を提供する。この組織透明化方法において、前記水溶性溶媒には、好ましくは2,2´-チオジエタノールとグリセロールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液との混合溶媒が用いられる。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


近年、形質転換技術及び遺伝子導入技術の進展に伴い、様々な臓器において特定の細胞のみを蛍光タンパク質で標識し観察することが行われている。例えば、脳内の種々の神経回路を選択的に蛍光標識し、蛍光を指標に3次元的に神経回路を可視化し再構築する試みがなされてきている。



従来、臓器の内部組織の観察は、固定、包埋した臓器(あるいは臓器片)を機械的に薄切して組織切片を作成し、光学顕微鏡下で観察することにより行われてきた。また、近年では、共焦点レーザー顕微鏡や多光子励起顕微鏡を用いて臓器を光学的に「切る」ことにより、内部組織の観察像を得られるようになっている。



神経回路等の組織構造を3次元的に観察する場合、上述の機械的手法では、連続的な組織切片を多数作成し、それらの蛍光画像を積み上げていくことが必要となり、非常な労力を伴う。一方、光学的手法では、光が臓器内部で散乱するため、観察する部位が臓器表面から深くなるにつれて蛍光画像の取得が困難となる問題(観察深度限界)がある。



観察深度限界は、一般に、共焦点レーザー顕微鏡で0.15mm程度、二光子励起顕微鏡で最大4mm程度とされている。例えば研究に汎用されるマウスの脳の場合、表層の皮質の厚さが約1mmであるので、皮質よりも脳の内側にある海馬や視床を観察するためには、観察深度限界を数ミリメートルまで広げる必要がある。



そこで、臓器内部での光の散乱を抑制して観察深度限界を広げるための技術として、臓器を透明化する技術が検討されてきている。例えば、非特許文献1には、テトラヒドロフランを用いた手法によって脳脊髄を透明化したことが報告されている。また、特許文献1及び非特許文献2には、高濃度の尿素を用いた手法(Scale法)によって脳を透明化できたことが記載されている。



非特許文献4には、2,2´-チオジエタノールを用いてトンボの胸部神経節やイカの皮膚などの組織を0.6mm程度の厚さまで透明化できたことが記載されている。また、これに先行する非特許文献5には、2,2´-チオジエタノールを封入剤に用いることが記載されている。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、組織透明化方法、組織透明化試薬及び組織観察方法に関する。より詳しくは、組織をその変化を引き起こすことなく、簡便かつ安全に透明化できる組織透明化方法等に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
2,2´-チオジエタノールと、グリセロール及び非イオン性有機ヨウ素化合物の少なくとも一方と、を含む水溶性溶媒中に組織を浸漬する手順を含む組織透明化方法。

【請求項2】
 
前記溶媒が、2,2´-チオジエタノールとグリセロールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液との混合液であり、2,2´-チオジエタノール、グリセロール及びヨウ素含有量40%の非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の容量比がそれぞれ10~50%、1~20%及び10~70%である請求項1記載の組織透明化方法。

【請求項3】
 
前記溶媒が、2,2´-チオジエタノールと非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の混合液であり、2,2´-チオジエタノール及びヨウ素含有量40%の非イオン性有機ヨウ素化合物水溶液の容量比が20~80%、80~20%である請求項1記載の組織透明化方法。

【請求項4】
 
前記溶媒が、2,2´-チオジエタノールとグリセロールとの混合液であり、2,2´-チオジエタノール及びグリセロールの容量比が70~95%、5~30%である請求項1記載の組織透明化方法。

【請求項5】
 
前記溶媒が、さらにスクロース水溶液を含む請求項1記載の組織透明化方法。

【請求項6】
 
前記溶媒の屈折率が、1.4~1.7である請求項1~5のいずれか一項に記載の組織透明化方法。

【請求項7】
 
前記組織が、脳、脊髄、肝臓、肺、心臓、血管及び癌からなる群より選択される一以上である請求項1~6のいずれか一項に記載の組織透明化方法。

【請求項8】
 
前記組織が1mm以上の厚さを有する請求項7記載の組織透明化方法。

【請求項9】
 
2,2´-チオジエタノールと、グリセロール及び非イオン性有機ヨウ素化合物の少なくとも一方と、を含む水溶性溶媒からなる組織透明化試薬。

【請求項10】
 
2,2´-チオジエタノールと、グリセロール及び非イオン性有機ヨウ素化合物の少なくとも一方と、を含む水溶性溶媒中に組織を浸漬する透明化手順を含む組織観察方法。

【請求項11】
 
前記組織を蛍光標識する標識手順と、
蛍光標識後の前記組織を前記溶媒中に浸漬する前記透明化手順と、
透明化後の組織中の前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する検出手順と、を含む請求項10記載の組織観察方法。

【請求項12】
 
前記組織を前記溶媒中に浸漬する前記透明化手順と、
透明化後の組織を蛍光標識する標識手順と、
透明化及び蛍光標識後の組織中の前記蛍光標識から発せられる蛍光を検出する検出手順と、を含む請求項10記載の組織観察方法。

【請求項13】
 
前記検出手順において、前記蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光実体顕微鏡、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡により観察する請求項11又は12記載の組織観察方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Published
Reference ( R and D project ) CREST Creation of a Novel Technology towards Diagnosis and Treatment based on Understanding of Molecular Pathogenesis of Psychiatric and Neurological Disorders AREA
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