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組織の冷却保存液 コモンズ

国内特許コード P020000204
整理番号 U1999P110
掲載日 2003年5月27日
出願番号 特願2000-057143
公開番号 特開2001-247401
登録番号 特許第3694730号
出願日 平成12年3月2日(2000.3.2)
公開日 平成13年9月11日(2001.9.11)
登録日 平成17年7月8日(2005.7.8)
発明者
  • 宮本 元
  • 杉本 実紀
  • 眞鍋 昇
出願人
  • 国立大学法人京都大学
発明の名称 組織の冷却保存液 コモンズ
発明の概要 この発明は、凍結保存において使用する、細胞又は組織の冷却保存液に関するものであり、特に、動物類の雌性生殖器官等の器官を保存するための冷却保存液に関するものであり、微小な細胞の保存のみならず、大きな組織の保存に対しても有効な冷却保存液を提供する。
この冷却保存液は、細胞膜透過性物質、氷晶形成抑止能力を有する物質、及び細胞膜非透過性脱水促進物質を含有することを特徴とする。なお、細胞膜透過性物質は、主としてメタノールであり、氷晶形成抑止能力を有する物質は、主としてエチレングリコールであり、細胞膜非透過性脱水促進物質は、主としてショ糖である。
従来技術、競合技術の概要
細胞を生かしたままである期間保存するには、大別して4℃程度の低温保存と凍結保存がある。低温保存は代謝速度を低下させて生存期間の延長を図るもので、細胞は比較的緩やかな生存率の減少を示し、実用的な保存期間は数日間から2週間程度である。一方、長期的な保存法としては、-80℃または-196℃の凍結保存がある。凍結保存は、細胞機能を回復可能な状態に保ったまま凍らせて保存することである。凍結保存は、グリセロールまたはジメチルスルホキシド(5~10%)を凍結保護剤として培地に加え、毎分1℃程度の速度でゆっくり凍結し、-196℃の液体窒素温度に保存したのち毎分200℃程度て急速に溶解し、保護剤を取り除いたのち培地に移す方法が標準的である。
【0003】
このような凍結保存において、凍結保存に用いる冷却保存液を改良し、より効果的な保存法の開発が行なわれている。細胞の保存のうち、特に生殖細胞の保存は、生物の系統を維持するための効率的な方法であり、保存された系統は遺伝資源として有効に活用できる。また生物集団の遺伝的多様性の維持にも役立つ。さらに、哺乳類においては、雌の成熟生殖子である卵子は極わずかしか排卵されないため、卵巣内に多数存在する未成熟卵母細胞を保存する方が効率が良い。
【0004】
かかる条件下、動物類の卵巣などの大きな組織の凍結保存のために、保護物質としてジメチルスルフォキシド、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ショ糖を用い、コンピューター制御されたプログラムフリーザーを利用した緩慢凍結法が知られている。
【0005】
さらに、精子、卵子、受精卵のような極微小な細胞の保存のために、冷却保存液として、例えば、ジメチルスルホキシド、アセトアミド、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの高濃度の保護物質を含有する急速冷却法(ガラス化法)が知られている。
ここで、このガラス化法について、捕捉説明する。ガラス化法とは、細胞や組織に含まれる水分にガラス化を起こさせて氷晶形成による傷害を避ける保存法である。水を氷点下まで冷却すると、通常は結晶構造を持つ氷に相転移し氷の結晶(氷晶)が形成される。細胞又は組織の保存のためには、細胞質内や細胞近傍に形成される氷晶による傷害の防止が必須である。そのために各種の方法が開発されてきたが、ガラス化法もその中の一種で、現在最も優れたものである。
【0006】
水は、特殊な条件下では氷晶形成することなくガラス状の非晶質の固体になる。このような、結晶化を伴わない固体化をガラス化(vitrification)と呼ぶ。水のガラス化が生じる条件としては、急速な冷却、高静水圧、および凍害保護物質の高濃度での存在が挙げられる。 これらはそれぞれ単独でもガラス化を起こさせることができるが、単独の場合は条件が非常に厳しくなり細胞死をもたらす。すなわち、冷却完了までの間に生じる細胞への悪影響、処理できる組織・細胞のサイズの制限から、細胞・組織の超低温保存においては単独使用できない。そのため、これまでに開発されているガラス化法では、高濃度の保護物質と急速冷却をたくみに併用することにより、これらの負の側面を緩和し、それぞれについて必要とされる条件が実用的なレベルになっている。
産業上の利用分野
本発明は、細胞又は組織の冷却保存液に関し、特に、動物類の雌性生殖器官等の器官を保存するための冷却保存液に関する。
特許請求の範囲 【請求項1】メタノール、又はエタノールから選択される少なくとも1つの細胞膜透過性物質と、ジメチルスルフォキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブタンジオール、2,3-ブタンジオール、及びグリセロールからなる群から選択される少なくとも1つの氷晶形成抑止能力を有する物質と、ショ糖、トレハロース、ラフィノース、ラクトース、フルクトースからなる群から選択される少なくとも1つの細胞膜非透過性脱水促進物質とを含有することを特徴とする組織の冷却保存液。
【請求項2】氷晶形成抑止能力を有する物質が、ジメチルスルフォキシドであることを特徴とする請求項1項に記載の冷却保存液。
【請求項3】氷晶形成抑止能力を有する物質が、エチレングリコールであることを特徴とする請求項1項に記載の冷却保存液。
【請求項4】細胞膜非透過性脱水促進物質が、ショ糖であることを特徴とする請求項1~3のいずれか1項に記載の冷却保存液。
産業区分
  • 薬品
  • 微生物工業
  • 治療衛生
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 権利存続中
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