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化学発光in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学的染色とを組合わせた二重標識検出法 コモンズ

国内特許コード P03A001158
掲載日 2004年4月16日
出願番号 特願平11-121519
公開番号 特開2000-310637
登録番号 特許第3127244号
出願日 平成11年4月28日(1999.4.28)
公開日 平成12年11月7日(2000.11.7)
登録日 平成12年11月10日(2000.11.10)
発明者
  • 納 光弘
出願人
  • 国立大学法人鹿児島大学
発明の名称 化学発光in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学的染色とを組合わせた二重標識検出法 コモンズ
発明の概要 本発明は、化学発光in situハイブリダイゼーションと発色による免疫組織化学的染色とを組合せた二重標識検出方法に関するものであり、二重標識検出法を同一標本において行うための方法と、これらの検出を共に高感度且つ高解像度で得るための検出装置を提供することを目的とする。本方法は、化学発光in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学的染色とを組合せた特定の核酸を有し且つ核酸以外の第2の細胞関連物質を有する組織又は細胞を検出するための二重標識検出方法であって、標本中の組織切片又は細胞に、目的とする細胞内核酸に対するプローブを用いて化学発光insituハイブリダイゼーションを行うこと、標本の発光画像を得ること、標本において発光を生じている位置を記憶すること、第2の細胞関連物質に対する抗体を用いて、免疫組織化学的染色を行うこと、記憶した位置において、免疫組織化学染色を施した標本の透過光画像を得る工程とを具備している。本発明の検出装置及び検出方法により、HAM患者におけるHTLV-Itax遺伝子の検出、及び患者から得られた感染細胞の細胞表現型の解析等、出現数の少ない感染細胞において発現する少量のmRNAを高感度に検出することが可能であり、さらに、検出された感染細胞の表現型を容易に決定することが可能である。
従来技術、競合技術の概要 細胞内において発現された物質の検出、並びに細胞の表現型の同定は、種々の疾患の病態機序を解明するための重要な手段である。核酸、タンパク等の細胞内において発現される物質を検出する手段として、mRNAをin situで検出する方法が広汎に使用されている。mRNAは、標識化プローブによるin situハイブリダイゼーション(in situ hybridization)で一般的に検出される。近年では、このようなmRNAの検出に、化学発光を指標として用いる試みが行われているが、化学発光物質を標識として用いたin situハイブリダイゼーション法には測定感度に限界がある。一方、科学の進歩により、微量な疾患関連因子やこれを発現する少数細胞を検出する必要が生じてきた。例えば、ヒトT細胞白血病ウイルスI型関連脊髄症(human T-lymphotropic virus type I-associated myelopathy:HAM)の発症には、HTLV-I(human T-lymphotropic virus)の感染が深く関与している(納光弘,HTLV-1-associated Myelopathy(HAM), medicina,1988 25(10):2216-2217)。しかしながら、HAMを発症する患者の末梢血においてHTLV-Itax遺伝子(HTLV-I に特異的な mRNA の配列の一部分)を発現する細胞は非常に少なく、また、HTLV-Iの発現量自体も非常に少ないため、従来の方法を用いての研究は非常に困難なものであった。その理由は、第1に、生体から得た標本中に目的とする感染細胞を発見することが難しいことである。第2に、仮に発見し得た場合でも、この同定された細胞自体に対して免疫組織化学的染色等の第2の異なる検出法を適用できない限り、発見した感染細胞の細胞表現型を決定することさえも困難なことである。更に、発現するmRNA量が少ないため、測定は高感度に行える方法に、現実的には化学発光in situハイブリダイゼーション法に限られてしまう。従って、同一の細胞に対して化学発光in situハイブリダイゼーション法と免疫染色法等の検出方法を合わせて実施することが可能であり、且つ該検出の感度が非常に優れた検出手段の開発が要望されていた。
産業上の利用分野 化学発光in situハイブリダイゼーション(chemiluminescent in situ hybridization)と発色による免疫組織化学的染色(immunohistochemistry)とを組合わせた二重標識検出方法
特許請求の範囲 【請求項1】 ヒトT細胞白血病ウイルスI型に感染した患者より得た標本中でHTLV-Itax遺伝子を発現している細胞を検出し、該細胞についてその細胞表現型を決定する方法であって、(1)標本中の組織切片又は細胞に、前記遺伝子に対するプローブを用いて化学発光in situハイブリダイゼーションを行なう工程と、(2)前記標本の透過光画像を得た後に発光画像を得る工程と、(3)該標本において発光を生じている位置を記憶する工程と、(4)次に、細胞関連物質に対する抗体を用いて、免疫組織化学的染色を行なう工程と、および(5)前記記憶した位置において、前記免疫組織化学染色を施した標本の透過光画像を得る工程と、を具備する方法。
【請求項2】 請求項1に記載の方法であって、前記(2)から(5)の工程を以下の要素;(1)目的とする標本上の全ての位置について画像を得ることができ、且つ検出位置の記憶及び記憶された検出位置の再現を行なうことができるXYステージを備えた落射蛍光顕微鏡と;(2)前記2台のCCDカメラと;(3)前記カメラに接続したデータ解析装置と;および(4)前記データ解析装置に接続したモニタ解析装置と、を具備する装置を用いることにより行なうことを特徴とする方法。
【請求項3】 請求項1または2の何れか1項に記載の方法であって、前記組織切片又は細胞がスライドグラスに具備されるチャンバー内に固定されることによって標本とされ、前記発光画像を得る工程における該標本には、ポリビニルアルコールを含有する染色液が具備されることを特徴とする方法。
産業区分
  • 試験、検査
  • 高分子化合物
  • 微生物工業
  • 治療衛生
  • 光学装置
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 権利存続中
鹿児島TLOでは鹿児島大学、鹿屋体育大学から特許に関する技術移転を受託しています。
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