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光連結性ヌクレオシド含有DNAを用いて塩基を点変異する方法 実績あり

国内特許コード P03A001968
整理番号 A051P187
掲載日 2003年10月1日
出願番号 特願2000-382283
公開番号 特開2002-179696
登録番号 特許第3753938号
出願日 平成12年12月15日(2000.12.15)
公開日 平成14年6月26日(2002.6.26)
登録日 平成17年12月22日(2005.12.22)
発明者
  • 齋藤 烈
  • 藤本 健造
  • 松田 成夫
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明の名称 光連結性ヌクレオシド含有DNAを用いて塩基を点変異する方法 実績あり
発明の概要 【課題】 本発明は、簡便で確実でかつ特異的であって、さらに低コストで無公害の点変異法を提供するものであり、実用化の可能な新規な遺伝子操作法を提供するものである。
【解決手段】 本発明は、変換したい塩基を有するDNA、RNA、PNAなどの核酸類を、光連結性ヌクレオシドを含有するDNAの存在下で、光照射して変換したい塩基と光連結性ヌクレオシドとを結合させ、変換したい塩基を化学的に変性させた後、光照射して変換したい塩基と光連結性ヌクレオシドとを解裂させることからなる核酸類中の特定の塩基を点変異させる方法、及びその方法により点変異した核酸類を製造する方法に関する。
従来技術、競合技術の概要


DNAやPNA(ペプチド核酸)などの核酸類中の特定の位置の塩基を他の塩基に変換する方法は、点変異(ポイントミューテーション)として変異した核酸類を調製したり、核酸類の機能解析のための技術として重要視されてきている。
しかし、従来の点変異の技術は酵素反応を用いるために特異性や確実性の点において充分ではなく、その効率も必ずしも充分ではなかった。また、酵素反応を用いた方法では、後処理の必要な化学活性化剤を使用しなければならず、コストがかかり、かつ反応条件の至適化や制御が難しく、実用化が困難であった。
また、任意の位置のシトシンのみをウラシルへと点変異させることは従来はできなかった。シトシンからウラシルへの変換は、任意の位置ではないが、同じ鎖内でピリミジンダイマー生成、デアミネーション、及びフォトリアーゼによる光解裂によりシトシンをウラシルへと変異させた例があるが、この方法では酵素を用いる点、他のサイトとの競争反応がある点、及び効率が低い点等において改良の余地があった。



一方、本発明者らは、先に光化学反応により光連結性ヌクレオシドを含有するDNAと、炭素-炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類(DNAやPNAなど)を光化学反応により連結と開裂を特異的に行うことができることを見出してきた(特願2000-67519号参照)。

産業上の利用分野


本発明は、DNA、RNA、PNAなどの核酸類中の特定の位置の塩基を、他の塩基に点変異させる方法、及びその方法により点変異した核酸類を製造する方法に関する。より詳細には、本発明は、核酸類中の特定の位置の塩基を、光連結性ヌクレオシドを含有するDNAの存在下で、光化学反応を利用して酵素の不存在下で他の塩基に変換することからなる核酸類中の特定の位置の塩基を点変異させる方法、及びその方法により点変異した核酸類を製造する方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
変換したい塩基としてシトシンを有する核酸類を、
次式I:
【化1】


(式中、ZはO又はNHを示し、X及びYの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、X及びYの残りの基は水素原子を示す。)
で表される基を有する光連結性ヌクレオシドを末端に含有するDNAの存在下で、光照射して変換したい塩基と前記光連結性ヌクレオシドとを結合させ、変換したい塩基を化学的に変性させた後、光照射して変換したい塩基と光連結性ヌクレオシドとを開裂させることからなる、核酸類中の塩基が点変異した核酸類を製造する方法。

【請求項2】
電子吸引性基が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基である請求項1に記載の方法。

【請求項3】
ZがOで、Xが水素原子で、Yがカルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基である請求項1又は請求項2に記載の方法。

【請求項4】
化学的に変性させる方法が、脱アミノ化である請求項1~3のいずれかに記載の方法。

【請求項5】
核酸類の一部を固定化させるためのテンプレートを用いる請求項1~4のいずれかに記載の方法。

【請求項6】
核酸類が、DNA、RNA、又はPNAである請求項1~5のいずれかに記載の方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 登録
参考情報 (研究プロジェクト等) CREST 単一分子・原子レベルの反応制御 領域
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