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基底膜標品又は人工組織

国内特許コード P04A004648
整理番号 Y02-P219
掲載日 2004年8月27日
出願番号 特願2002-278244
公開番号 特開2003-169847
登録番号 特許第3829193号
出願日 平成14年9月24日(2002.9.24)
公開日 平成15年6月17日(2003.6.17)
登録日 平成18年7月21日(2006.7.21)
優先権データ
  • 特願2001-292675 (2001.9.25) JP
発明者
  • 持立 克身
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
  • 国立研究開発法人国立環境研究所
発明の名称 基底膜標品又は人工組織
発明の概要 【課題】 基底膜や人工組織の調製時にはプラスチック表面に吸着・固定しているが、所望時にはプラスチック表面から物理的に剥離させることができるように仮接着しているタンパク性支持体上に形成されており、基底膜の構造を保持したままで移植が可能なことから、その汎用性が一層高い基底膜標品や人工組織を提供すること。
【解決手段】 メチルビニルエ-テルと無水マレイン酸との交互共重合体等の分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とタンパク質と反応しうる官能基とを有する疎水結合性吸着ポリマーを介して、プラスチック表面にタンパク性支持体を仮接着し、その上に基底膜標品又は人工組織を形成させ、所望時にプラスチック表面から基底膜標品又は人工組織を担持したタンパク性支持体を物理的に剥離させ、基底膜の構造を保持したままで移植可能な基底膜標品又は人工組織を調製する。
従来技術、競合技術の概要


動物の体の内外の表面を覆っている細胞層である表皮、角膜上皮、肺胞上皮、消化器系の粘膜上皮、腎臓子球体上皮、肝実質細胞等の上皮組織は、外界から異物(微生物、アレルゲン、化学物質等)が侵入するのを防いでいる。かかる上皮組織を構成する上皮細胞の外界面は上端面(apical)、内側下面は基底面(basal)と呼ばれ、かかる基底面直下には、蛋白質やプロテオグリカン等の細胞外基質(ECM)から成る(細胞を含まない)基底膜と呼ばれる50~100nmの薄膜の構造体が存在する。基底膜は、未成熟な上皮細胞が増殖し、成熟した細胞に分化して、本来の形態や、機能を発現するのに必須の構造体と考えられている。即ち、基底膜なしでは上皮組織は自分自身の維持や本来のパフォーマンスが達成できない。多層又は単層の上皮細胞層はバリアーとして外界からの異物の侵入を防いでいるが、基底膜自体も物理的なバリアーとして作用する。このように、上皮組織を構成する上皮細胞と基底膜が協働して、強固なバリアーを形成し、体内の生命活動を保護している。



上皮細胞の他、内皮細胞、筋細胞、脂肪細胞、シュワン細胞などの実質細胞と結合組織との界面に形成される細胞外基質の特異な膜状構造物である基底膜は、生体の各組織・臓器に普遍的に見い出される一方で、腎糸球体毛細血管ループや神経シナプス膜など高度に特化したものもある。したがって、細胞を間質に接着させるだけでなく、選択的な物質・細胞透過や細胞分化の誘導等の機能が明らかにされている。腎糸球体では、基底膜の陰性荷電が腎のろ過機能を担っているとみなされ、その陰性荷電は現在パールカンとよばれるヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)によることが古典的に知られている。HSPGは腎糸球体基底膜だけでなく、種々の基底膜に、IV型コラーゲン、ラミニン、エンタクチン等と同様に、その基本的構成分子としてひろく分布している。



細胞外マトリックス、特に基底膜は、上記のように個体の発生や分化等の生理現象だけでなく、癌の増殖転移や炎症などの病態形成にも深く関与していることが明らかとなりつつあり、その構成タンパク質の機能の解明が重要な課題となってきている。例えば、基底膜の主要糖タンパク質であるラミニンは、α、β、γの3種類のサブユニットからなる複合体で、15種類のアイソフォームが知られており、これらが組織特異的あるいは発生時の各段階で特異的に発現している。ラミニンは様々な生物活性を有し、20種類以上のラミニンレセプターが報告されている分子量90万の複雑な巨大分子である。



細胞が接着可能な薄い細胞外マトリックス層である基底膜の構成成分と上皮細胞との相互作用が、移動、増殖及び分化等の細胞機能に影響を及ぼしている(例えば、非特許文献1参照。)。基底膜の主要成分としては、前記のように、ラミニン、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)及びエンタクチンが知られており(例えば、非特許文献2参照。)、ラミニン及びIV型コラーゲンのアイソフォームを含む基底膜成分の合成には、間充織細胞が重要な役割を担っていると考えられている(例えば、非特許文献3、4参照。)が、上皮細胞の役割もまた、重要なものである。HSPGは、上皮細胞由来と考えられているが、ラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンは、上皮細胞及び間充織細胞の双方によって、インビボで合成される(例えば、非特許文献5、6参照。)。連続した緻密層(lamina densa)を示すインビトロでの上皮組織モデルを作製する試みが、今まで数多く行われてきた。腸(例えば、非特許文献7参照。)及び皮膚(例えば、非特許文献8、9、10参照。)等の組織モデルが研究されており、いくつかの間充織細胞由来基底膜成分が、基底膜形成に重要な役割を果たしていることも見い出されている。



従来から、上皮細胞を培養することにより基底膜を構築し、基底面直下に基底膜構造体が存する上皮組織を構築する幾つかの方法が報告されている。例えば、本発明者は、肺胞上皮細胞と肺線維芽細胞との共培養によりインビトロで基底膜が形成されることを報告した(例えば、非特許文献11参照。)。すなわち、肺線維芽細胞をI型コラーゲンゲルに包埋した状態で順化培養すると、肺線維芽細胞によってコラーゲンゲルは収縮し堅さを増し、また分泌された細胞外基質が細胞周囲のコラーゲン線維にまとわりついて沈着し、その形成物はインビボにおける間質と類似することから擬似間質と呼ばれ、この擬似間質化したI型コラーゲン線維上で、II型肺胞上皮細胞株(SV40-T2)を14日間程度培養する(T2-Fgel)と、肺線維芽細胞が分泌する細胞外基質中のIV型コラーゲンやラミニン等の基底膜構成成分が培地中に拡散して、上記II型肺胞上皮細胞株の基底面に到達し、基底膜構築材料として使われる結果、基底膜構造体が形成されることを報告した。



また、希薄な中性コラーゲン溶液を、5%CO2中37℃でインキュベートし、コラーゲン線維を形成させた後、無菌状態の中で風を当てて乾燥させた風乾コラーゲン線維基質(fib)を、上記擬似間質の代替物として用い、上記肺胞上皮細胞と肺線維芽細胞との共培養の場合と同様にして、基底膜を形成することも報告されている(例えば、非特許文献12、13参照。)。この方法の場合、コラーゲン溶液の濃度が高いと、形成されたコラーゲン線維に隙間が少なく、あるいはなくなって、基底膜形成のため上皮細胞を長期間培養(10日~2週間)すると、細胞が剥がれて浮き上がることから(例:Becton Dickinson, Fibrillar collagen coat culture insert)、コラーゲン溶液濃度は、0.3~0.5mg/mlが最適であるとされている(例えば、非特許文献12、13参照。)。



線維芽細胞を包埋したコラーゲンマトリックスを使用する代わりに、マトリゲル(Matrigel;Becton Dickinson社の登録商標)を加えたコラーゲン線維基質上で、II型肺胞上皮細胞株(SV40-T2)を培養した。このときマトリゲルは、基底膜成分の外来性(exogenous)供給源として機能した。マトリゲルは、Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍マトリックスから抽出された基底膜調製物であり(例えば、非特許文献14参照。)、ECM合成に影響を及ぼす可能性のある種々のサイトカインの他に、ラミニン-1、エンタクチン、IV型コラーゲン、パールカンを含んでいる(例えば、非特許文献15参照。)。基底膜に取り込まれたマトリゲルの成分を追跡するために、マトリゲルをビオチンで標識し、基底膜成分であるラミニン、エンタクチン、IV型コラーゲン、パールカンの免疫蛍光染色と電子顕微鏡観察により、マトリゲル量に依存して基底膜形成が促進し、点状に分泌された基底膜マトリックスがシート状に沈着して基底膜が発達してゆく過程が観察された。その結果、肺胞上皮細胞の下方にて、安定化した外来性ラミニン-1及びエンタクチンが、インビトロでの上記上皮細胞による基底膜の完全なる発達に大きく関与していることが明らかになっている(例えば、非特許文献13参照。)。



【非特許文献1】
Crouch et al., Basement membrane. .In The Lung(ed .R. G. Crystal and J. B. West), pp53.1-53.23. Philadephia : Lippincott-Raven. 1996
【非特許文献2】
Curr. Opin. Cell Biol. 6, 674-681, 1994
【非特許文献3】
Matrix Biol. 14, 209-211, 1994
【非特許文献4】
J. Biol. Chem. 268, 26033-26036, 1993
【非特許文献5】
Development 120, 2003-2014, 1994
【非特許文献6】
Gastroenterology 102, 1835-1845, 1992
【非特許文献7】
J. Cell Biol. 133, 417-430, 1996
【非特許文献8】
J. Invest. Dermatol. 105, 597-601, 1995
【非特許文献9】
J. Invest. Dermatol. 109, 527-533, 1997
【非特許文献10】
Dev. Dynam. 197, 255-267, 1993
【非特許文献11】
Cell Struc.Func., 22: 603-614, 1997
【非特許文献12】
Eur. J. Cell Biol., 78: 867-875, 1999
【非特許文献13】
J. Cell Sci., 113: 859-868, 2000
【非特許文献14】
J. Exp. Med. 145, 204-220, 1977
【非特許文献15】
Exp. Cell Res. 202, 1-8, 1992
【非特許文献16】
Clement et al.,Exp.Cell Res., 196: 198-205, 1991

産業上の利用分野


本発明は、プラスチック表面に仮接着しているタンパク性支持体上に形成されている基底膜標品や人工組織、詳しくは、プラスチック表面に吸着しているが、所望時にはプラスチック表面から物理的に剥離させることができるように仮接着しているタンパク性支持体上に形成されている、細胞の形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を持った細胞外マトリックスである基底膜の標品や、人工血管、人工肺、人工肝、人工腎臓、人工皮膚、人工角膜等の人工組織(組織モデル)及びそれらの製造方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
分子内に、疎水性を有する直鎖状炭素骨格と、タンパク質と反応しうる官能基とを有する疎水結合性吸着ポリマーを介して、プラスチック表面に仮接着しているタンパク性支持体上に形成されていることを特徴とする基底膜標品。

【請求項2】
疎水結合性吸着ポリマーが、以下の一般式[I]で表される疎水結合性吸着ポリマーであることを特徴とする請求項1記載の基底膜標品。
【化1】


(式中、XはCH又はNHCHCOを示し、YはCH又はNHCR2COを示し、R1はH、C1~C3のアルキル基、C1~C3のアルコキシ基又はC6~C8のアリール基を示し、R2はH又はC1~C3のアルキル基を示し、Zは官能基(反応基)を示し相互に結合してもよく、spacerは(-CH2-)p又は(-NHCHR3HCO-)qを示し、R3はH又はC1~C3のアルキル基を示し、mは1以上の整数を、nは100~20000の整数を、p及びqは独立して0又は1~8の整数を、rは1以上の整数を示す。)

【請求項3】
一般式[I]で表される疎水結合性吸着ポリマーが、メチルビニルエ-テルと無水マレイン酸との交互共重合体であることを特徴とする請求項2記載の基底膜標品。

【請求項4】
基底膜標品が、基底膜を介してタンパク性支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶媒とアルカリ溶液を用いて除去することにより作製された基底膜標品であることを特徴とする請求項1~3のいずれか記載の基底膜標品。

【請求項5】
基底膜形成能を有する細胞が、上皮細胞又は内皮細胞であることを特徴とする請求項1~のいずれか記載の基底膜標品。

【請求項6】
タンパク性支持体が、線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲルであることを特徴とする請求項1~のいずれか記載の基底膜標品。

【請求項7】
分子内に、疎水性を有する直鎖状炭素骨格と、タンパク質と反応しうる官能基とを有する疎水結合性吸着ポリマーを介して、プラスチック表面にタンパク性支持体を仮接着し、その上に基底膜標品を形成させ、所望時にプラスチック表面から基底膜標品を担持したタンパク性支持体を物理的に剥離させることを特徴とする基底膜の構造を保持したままで移植可能な基底膜標品の製造方法。

【請求項8】
疎水結合性吸着ポリマーが、以下の一般式[I]で表される疎水結合性吸着ポリマーであることを特徴とする請求項記載の基底膜の構造を保持したままで移植可能な基底膜標品の製造方法。
【化2】


(式中、XはCH又はNHCHCOを示し、YはCH又はNHCR2COを示し、R1はH、C1~C3のアルキル基、C1~C3のアルコキシ基又はC6~C8のアリール基を示し、R2はH又はC1~C3のアルキル基を示し、Zは官能基(反応基)を示し相互に結合してもよく、spacerは(-CH2-)p又は(-NHCHR3HCO-)qを示し、R3はH又はC1~C3のアルキル基を示し、mは1以上の整数を、nは100~20000の整数を、p及びqは独立して0又は1~8の整数を、rは1以上の整数を示す。)

【請求項9】
一般式[I]で表される疎水結合性吸着ポリマーが、メチルビニルエ-テルと無水マレイン酸との交互共重合体であることを特徴とする請求項記載の基底膜の構造を保持したままで移植可能な基底膜標品の製造方法。

【請求項10】
基底膜標品が、基底膜を介してタンパク性支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶媒とアルカリ溶液を用いて除去することにより作製された基底膜標品であることを特徴とする請求項7~9のいずれか記載の基底膜の構造を保持したままで移植可能な基底膜標品の製造方法。

【請求項11】
基底膜形成能を有する細胞が、上皮細胞又は内皮細胞であることを特徴とする請求項7~10のいずれか記載の基底膜の構造を保持したままで移植可能な基底膜標品の製造方法。

【請求項12】
タンパク性支持体が、線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲルであることを特徴とする請求項7~11のいずれか記載の基底膜の構造を保持したままで移植可能な基底膜標品の製造方法。

【請求項13】
分子内に、疎水性を有する直鎖状炭素骨格と、タンパク質と反応しうる官能基とを有する疎水結合性吸着ポリマーを介して、プラスチック表面に仮接着しているタンパク性支持体上に形成されていることを特徴とする人工組織。

【請求項14】
疎水結合性吸着ポリマーが、以下の一般式[I]で表される疎水結合性吸着ポリマーであることを特徴とする請求項13記載の人工組織。
【化3】


(式中、XはCH又はNHCHCOを示し、YはCH又はNHCR2COを示し、R1はH、C1~C3のアルキル基、C1~C3のアルコキシ基又はC6~C8のアリール基を示し、R2はH又はC1~C3のアルキル基を示し、Zは官能基(反応基)を示し相互に結合してもよく、spacerは(-CH2-)p又は(-NHCHR3HCO-)qを示し、R3はH又はC1~C3のアルキル基を示し、mは1以上の整数を、nは100~20000の整数を、p及びqは独立して0又は1~8の整数を、rは1以上の整数を示す。)

【請求項15】
一般式[I]で表される疎水結合性吸着ポリマーが、メチルビニルエ-テルと無水マレイン酸との交互共重合体であることを特徴とする請求項14記載の人工組織。

【請求項16】
人工組織が、タンパク性支持体上で、基底膜形成能を有する細胞を培養することにより調製された基底膜であることを特徴とする請求項13~15のいずれか記載の人工組織。

【請求項17】
人工組織が、基底膜形成能を有する細胞の基底面に、基底膜構成成分の集積作用を有するレセプターを局在化させることができる糖鎖を備えたタンパク性支持体上で、基底膜形成能を有する細胞を培養することにより調製された人工組織であることを特徴とする請求項13~15のいずれか記載の人工組織。

【請求項18】
人工組織が、基底膜標品上に所定の基底膜形成能を有する細胞を播種し、培養することにより調製された再構築人工組織であることを特徴とする請求項13~15のいずれか記載の人工組織。

【請求項19】
基底膜形成能を有する細胞が、上皮細胞又は内皮細胞であることを特徴とする請求項13~18のいずれか記載の人工組織。

【請求項20】
タンパク性支持体が、線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲルであることを特徴とする請求項13~19のいずれか記載の人工組織。

【請求項21】
人工組織が、人工表皮組織、人工角膜上皮組織、人工肺胞上皮組織、人工気道上皮組織、人工腎糸球体組織、人工肝実質組織若しくは人工肺動脈血管内皮組織、又は人工血管、人工肺、人工肝、人工腎臓、人工皮膚若しくは人工角膜であることを特徴とする請求項13~20のいずれか記載の人工組織。

【請求項22】
分子内に、疎水性を有する直鎖状炭素骨格と、タンパク質と反応しうる官能基とを有する疎水結合性吸着ポリマーを介して、プラスチック表面にタンパク性支持体を仮接着し、その上に人工組織を形成させ、所望時にプラスチック表面から人工組織を担持したタンパク性支持体を物理的に剥離させることを特徴とする基底膜の構造を保持したままで移植可能な人工組織の製造方法。

【請求項23】
疎水結合性吸着ポリマーが、以下の一般式[I]で表される疎水結合性吸着ポリマーであることを特徴とする請求項22記載の基底膜の構造を保持したままで移植可能な人工組織の製造方法。
【化4】


(式中、XはCH又はNHCHCOを示し、YはCH又はNHCR2COを示し、R1はH、C1~C3のアルキル基、C1~C3のアルコキシ基又はC6~C8のアリール基を示し、R2はH又はC1~C3のアルキル基を示し、Zは官能基(反応基)を示し相互に結合してもよく、spacerは(-CH2-)p又は(-NHCHR3HCO-)qを示し、R3はH又はC1~C3のアルキル基を示し、mは1以上の整数を、nは100~20000の整数を、p及びqは独立して0又は1~8の整数を、rは1以上の整数を示す。)

【請求項24】
一般式[I]で表される疎水結合性吸着ポリマーが、メチルビニルエ-テルと無水マレイン酸との交互共重合体であることを特徴とする請求項23記載の基底膜の構造を保持したままで移植可能な人工組織の製造方法。

【請求項25】
人工組織が、タンパク性支持体上で、基底膜形成能を有する細胞を培養することにより調製された基底膜であることを特徴とする請求項22~24のいずれか記載の基底膜の構造を保持したままで移植可能な人工組織の製造方法。

【請求項26】
人工組織が、基底膜形成能を有する細胞の基底面に、基底膜構成成分の集積作用を有するレセプターを局在化させることができる糖鎖を備えたタンパク性支持体上で、基底膜形成能を有する細胞を培養することにより調製された人工組織であることを特徴とする請求項22~24のいずれか記載の基底膜の構造を保持したままで移植可能な人工組織の製造方法。

【請求項27】
人工組織が、基底膜標品上に所定の基底膜形成能を有する細胞を播種し、培養することにより調製された再構築人工組織であることを特徴とする請求項22~24のいずれか記載の基底膜の構造を保持したままで移植可能な人工組織の製造方法。

【請求項28】
基底膜形成能を有する細胞が、上皮細胞又は内皮細胞であることを特徴とする請求項22~27のいずれか記載の基底膜の構造を保持したままで移植可能な人工組織の製造方法。

【請求項29】
タンパク性支持体が、線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲルであることを特徴とする請求項22~28のいずれか記載の基底膜の構造を保持したままで移植可能な人工組織の製造方法。

【請求項30】
人工組織が、人工表皮組織、人工角膜上皮組織、人工肺胞上皮組織、人工気道上皮組織、人工腎糸球体組織、人工肝実質組織若しくは人工肺動脈血管内皮組織、又は人工血管、人工肺、人工肝、人工腎臓、人工皮膚若しくは人工角膜であることを特徴とする請求項22~29のいずれか記載の基底膜の構造を保持したままで移植可能な人工組織の製造方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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