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chib2型キチナーゼの製造法

国内特許コード P04A004772
掲載日 2004年11月29日
出願番号 特願平11-298255
公開番号 特開2001-112469
登録番号 特許第3108767号
出願日 平成11年10月20日(1999.10.20)
公開日 平成13年4月24日(2001.4.24)
登録日 平成12年9月14日(2000.9.14)
発明者
  • 荒平 正緒美
  • 深澤 親房
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 chib2型キチナーゼの製造法
発明の概要 【課題】 原料のダイズからPR-8キチナーゼファミリーに属し、新規なクラスであるchib2型のキチナーゼを、簡便なカラム操作で、短時間に効率よく分離、精製する方法を開発すること。
【解決手段】 脱脂大豆粉を脱イオン水又は酢酸緩衝液で抽出し、得られた抽出液からタンパク質画分を分離した後、該タンパク質画分を透析処理し、次いで疎水性クロマトグラフィーを行い、得られた溶出液からキチナーゼ活性を有する画分を分離し、再度疎水性クロマトグラフィーを行うことを特徴とする精製chib2型キチナーゼの製造法、および、得られた精製chib2型キチナーゼを、マンノース結合性レクチンを不溶性担体に結合させたカラムに通すことにより、糖鎖のあるものとないものとに分離することを特徴とする精製chib2型キチナーゼの製造法。
従来技術、競合技術の概要



キチナーゼ〔EC 3.2.1.14〕は、N-アセチル-D-グルコサミンのポリマーであるキチンのβ-1,4結合に作用する加水分解酵素である。キチナーゼは、4つのファミリーに分類され、このうちのクラスI(chia1型)、クラスII(chia2型)およびクラスIV(chia4型)は共通の性質を有し、PR-3キチナーゼファミリーに属している。一方、クラスIIIは上記3クラスの酵素とは異なる性質を示し、PR-8キチナーゼファミリーに属する。

従来、クラスIIIには、植物においてchib1型キチナーゼの存在のみが確認されていたが、本発明者らの研究の結果、ダイズにおいて、chib2型のキチナーゼの存在が確認された(Yeboah, N. A., Arahira, M., Nong, V. H., Zhang, D., Kadokura, K., Watanabe, A. and Fukazawa, C. (1998) A class III acidic endochitinase is specifically expressed in the developing seeds of soybean (Glycine max [L.] Merr.) Plant Molecular Biology, 36, 407-415) 。

chib2型のキチナーゼは、chib1型キチナーゼと相同性が高いことから、同じクラスIIIのPR-8キチナーゼファミリーに分類されている。構造的には、C末端部分の配列が明らかに長いことにおいて、chib1型キチナーゼと相違している。また、この酵素には糖鎖を有しているものと有していないものとがある。chib2型のキチナーゼは、種子の成長初期から終期までの長期間にわたり分泌されており、ダイズの成長期の防御のみならず、休眠期の防御にも深く関係していることが分かっている。

chib2型のキチナーゼは、前記したように、本発明者らによって初めて見出されたものである。ダイズから該酵素を分離、精製するための操作は、上記文献に記載されているように、極めて複雑で長時間を要する上に、酵素の収率が低く、実用性に欠けるものである。

産業上の利用分野



本発明は、ダイズ種子や脱脂ダイズ粉などからPR-8キチナーゼファミリーに属するchib2型のキチナーゼを簡便に、且つ大量に製造する方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
脱脂大豆粉を脱イオン水又は酢酸緩衝液で抽出し、得られた抽出液からタンパク質画分を分離した後、該タンパク質画分を透析処理し、次いで疎水性クロマトグラフィーを行い、得られた溶出液からキチナーゼ活性を有する画分を分離し、再度疎水性クロマトグラフィーを行うことを特徴とする精製chib2型キチナーゼの製造法。

【請求項2】
請求項1記載の方法によって得られた精製chib2型キチナーゼを、マンノース結合性レクチンを不溶性担体に結合させたカラムに通すことにより、糖鎖のあるものとないものとに分離することを特徴とする精製chib2型キチナーゼの製造法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 登録


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