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オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた乳酸菌の菌種同定法

国内特許コード P04A005144
掲載日 2005年1月11日
出願番号 特願2000-154289
公開番号 特開2001-333777
登録番号 特許第3448639号
出願日 平成12年5月25日(2000.5.25)
公開日 平成13年12月4日(2001.12.4)
登録日 平成15年7月11日(2003.7.11)
発明者
  • 野村 将
  • 小林 美穂
  • 岡本 隆史
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた乳酸菌の菌種同定法
発明の概要 本発明は、乳酸菌ラクトコッカス・ラクチスに特異的な塩基配列を有するDNAプライマーと、これを用いてPCR反応を行うことによって、乳酸菌を簡便、迅速かつ正確に同定・検出する方法である。ラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズラクチスおよびラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズクレモリスのグルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子の表現型の差異が遺伝子の変異に起因することが判明した。この遺伝子変異による菌種特異的な配列を検出することができるDNAプライマーとそのプライマーを用いた乳酸菌菌種の同定・検出方法である。上記2つの亜種の同定・検出には本発明で配列が示された3組のオリゴヌクレオチドの組み合せた中から選択したものをプライマーとして用いる。
従来技術、競合技術の概要


乳酸菌ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) は乳製品製造、特にチーズ製造に必須で、発酵スターターとして原料乳に接種される。乳に接種された乳酸菌は乳酸発酵を行い、製造に必要なpH環境を作り出し、チーズの物性を改善し、雑菌による汚染を防止する。また、様々な酵素を放出して熟成過程にも関与している。ラクトコッカス・ラクチスは、その微生物学的性状の違いからラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラクチス(Lactococcus lactis subsp. lactis) とラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ クレモリス(Lactococcuslactis subsp. cremoris) の二亜種に分類される。さらに、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラクチスの中でジアセチルを生成するものを、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラクチス バイオバラエティー ジアセチラクチス(Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis)として区別している。チーズ用のスターターとしては、酸生成力が適当である、チーズフレーバーを生成する、高温(40℃)で生育しない等の性質がチーズ製造に適しているラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ クレモリスが好適なものとして使用されている。また、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ ラクチスバイオバラエティー ジアセチラクチスも独特のフレーバーを付与するために、スターターとして用いられる場合がある。微生物による風味の形成は同じ菌種であっても株ごとに異なるため、さらなる利用価値の高い菌株を求めて、現在でも世界各地の伝統的な発酵乳製造現場から乳酸菌の分離が行われている。分離された菌株については、菌種の同定が必要不可欠である。通常、菌種の同定は、Bergy's manual of systematic bacteriology にしたがって被検菌の鏡検による形態観察および生理・生化学的試験、すなわち表現形質によって行われている。しかしながら、表現形質を基にした同定法は非常に煩雑で判定に熟練と技能を要し、多大な時間と労力を要する。そのため、近年においては微生物のDNA情報を解析する手法が開発されてきた。16S rDNAの塩基配列が決定され、またDNA-DNAホモロジーを調べるハイブリダイゼーションプローブやポリメラーゼ連鎖反応法(以下、PCRと略記することがある。)用のDNAプライマーが開発された。ラクトコッカス・ラクチスにおいても、菌種特異的なハイブリダイゼーションプローブやDNAプライマーが開発された。また、ラクトコッカス・ラクチスの亜種判別には、アルギニンデイミナーゼ活性を検出するのが一般的であるが、最近になってγーアミノ酪酸生成能の表現型によって亜種が判別できることが明らかとなり、この性質を用いた亜種判別法が開発された。γーアミノ酪酸は、L-グルタミン酸からグルタミン酸脱炭酸酵素の作用によって生成するアミノ酸である。

産業上の利用分野


乳酸菌の同定・検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた乳酸菌の同定・検出方法に関し、詳しくは乳酸菌のグルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子に特異的な塩基配列およびそれを用いて特定の乳酸菌を正確、迅速、かつ簡便に同定・検出する方法

特許請求の範囲 【請求項1】
配列表の配列番号1および2に記載の塩基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチド。

【請求項2】
配列表の配列番号3および4に記載の塩基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチド。

【請求項3】
配列表の配列番号5および6に記載の塩基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチド。

【請求項4】
請求項1~3のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせから選択される1または2以上を使用することを特徴とする乳酸菌の同定・検出方法。

【請求項5】
被検菌のゲノムDNAを鋳型とし、請求項1~3のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせから選択される1または2以上をプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を含む請求項4記載の乳酸菌の同定・検出方法。

【請求項6】
被検菌のゲノムDNAを鋳型とし、請求項1~3のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせから選択される1または2以上をプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅したDNA断片中における配列表の配列番号7記載の塩基配列の有無を検出することを特徴とする請求項4記載の乳酸菌の同定・検出方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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08706_01SUM.gif
出願権利状態 登録


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