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エポキシド水解酵素の活性測定方法

国内特許コード P04A005170
掲載日 2005年1月11日
出願番号 特願平11-020022
公開番号 特開2000-217597
登録番号 特許第3062600号
出願日 平成11年1月28日(1999.1.28)
公開日 平成12年8月8日(2000.8.8)
登録日 平成12年5月12日(2000.5.12)
発明者
  • 荒平 正緒美
  • 深澤 親房
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 エポキシド水解酵素の活性測定方法
発明の概要 【課題】 植物種子由来のエポキシド水解酵素の活性を、特別に化学合成した基質を用いたり、基質を放射性同位元素で標識することなく、迅速かつ簡便に測定する方法を提供すること。
【解決手段】 植物種子由来のエポキシド水解酵素を、アセトニトリルに溶解させたスチレンオキサイドに作用させ、生成したスチレングリコールを、移動相にアセトニトリルを用いる高速液体クロマトグラフィーで測定することを特徴とするエポキシド水解酵素の活性測定方法。
従来技術、競合技術の概要



エポキシド水解酵素は、過酸化反応などによって生体内に生じたエポキシド化合物を加水分解することによりジオール等を生成させ、該化合物による有害な化学反応を回避する作用を有している。エポキシド水解酵素は、動物の他、種々の植物に含まれているが、特に植物において、該酵素の活性は過酸化物の一種であるエポキシドを無毒化する活性のため、植物の環境適応能力を表す一つの指標となりうる可能性をもっている。

このため、植物に由来するエポキシド水解酵素の活性を、簡便に、かつ正確に測定する方法が要求されている。従来、該酵素の活性測定方法として、様々な方法が報告されている。一般に、酵素活性の定量法としては吸光度測定法、蛍光光度測定法、生成物の放射活性測定法などがあるが、エポキシド水解酵素の活性を定量する方法として、吸光度測定法や放射性同位元素を利用した活性測定法などがある。

このうち、Dietzeらによって報告された吸光度測定方法(Dietze, E. C. et al., Analytical Biochemistry, 216, 176-187(1994))は、吸光度を測定するために適したエポキシド基質を化学合成した後、該基質にエポキシド水解酵素を作用させ、その結果生じた微量の生成物の吸光度を測定する方法である。しかし、この方法においては、吸光度の測定に適したエポキシド基質を合成しなければならない上に、基質合成の成否を核磁気共鳴法(NMR)によって確認する必要があるため、基質の入手が困難であり、簡便に利用できる方法ではない。

また、Gillらによって報告された放射性同位元素を利用した活性測定方法(Gill, S. S. et al., Analytical Biochemistry, 131, 273-282(1993))は、エポキシド化合物として 3H等の放射性同位元素で標識したエポキシド基質を合成し、該化合物にエポキシド水解酵素を作用させた後、生成物を抽出,薄相クロマトグラフィー等を用いて分離し、その放射活性を液体シンチレーションカウンターにより測定する方法である。この方法は、生成物を高感度で測定できるという利点があるけれども、エポキシド基質を放射性同位元素で標識することが必要であり、このようなエポキシド基質は一般的に合成できるものではない。また、酵素活性測定時においても、抽出や薄相クロマトグラフィー等の煩雑な操作が必要であるため、簡便に利用できる方法とはいえない。

産業上の利用分野



本発明は、エポキシド水解酵素の活性測定方法に関し、詳しくは植物種子由来のエポキシド水解酵素の活性を、放射性基質を使用することなく迅速、かつ簡便に測定する方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
植物種子由来のエポキシド水解酵素を、アセトニトリルに溶解させたスチレンオキサイドに作用させ、生成したスチレングリコールを、移動相にアセトニトリルを用いる高速液体クロマトグラフィーで測定することを特徴とするエポキシド水解酵素の活性測定方法。

【請求項2】
酵素反応液中の基質スチレンオキサイドの終濃度が2~4mM、溶媒アセトニトリルの終濃度が1~2%(v/v)である請求項1記載の方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 登録


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