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植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法

国内特許コード P04A005171
掲載日 2005年1月11日
出願番号 特願平10-327536
公開番号 特開2000-139498
登録番号 特許第3015886号
出願日 平成10年11月4日(1998.11.4)
公開日 平成12年5月23日(2000.5.23)
登録日 平成11年12月24日(1999.12.24)
発明者
  • 荒平 正緒美
  • 深澤 親房
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法
発明の概要 【課題】 植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼの酵素活性を迅速に測定することができ、しかも特異的、かつ簡便に測定することが可能な該酵素活性の定量法を提供すること。
【解決手段】 アミノ酸配列中にアスパラギン残基を少なくとも1つ有すると共に、アスパラギン残基のC-末端側がイソロイシン残基、ロイシン残基及びバリン残基のいずれでもないオリゴペプチドであって、7-メトキシクマリン-4-yl-アセチル基をN-末端側に、2,4-ジニトロフェニル基をC-末端側に配した消光性蛍光基質を用いて、アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼにより切断された消光性蛍光基質から生ずる蛍光を測定することを特徴とする植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法。
従来技術、競合技術の概要



アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼとは、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列のうち、アスパラギン残基のC-末端でペプチド等を切断する酵素をいう。この中でも、特に植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼをレグマチュレインという。

レグマチュレインは、優れた蛋白源として食品産業等における有用性の高い植物種子の貯蔵タンパク質の合成に係わる酵素である。例えば、ダイズグリシニンは、当初酸性サブユニットと塩基性サブユニットがつながった状態の一本のポリペプチドから成るダイズグリシニン前駆体として合成される。その後、レグマチュレインの作用を受けて、サブユニット間が切断されてはじめて、成熟体としてのグリシニンとなる。したがって、レグマチュレインの酵素活性は、グリシニン等の貯蔵タンパク質の工業的利用性に影響するものである。

上記の事情より、レグマチュレインの酵素活性の正確な定量法が要求され、従来は以下の方法が用いられていた(特公平8-24576号公報参照)。 イミュノブロット法での定性的な測定法これは、ダイズグリシニン等の前駆体等をはじめとする天然の11S型種子貯蔵蛋白質前駆体を大腸菌体内で発現させて精製した後に、これらを基質としてレグマチュレインで切断し、生じてくる酸性サブユニット及び塩基性サブユニットをSDS-PAGEで分離する。次いで、PVDF膜にブロッティングした後、塩基性サブユニットに対する抗体を用いて、該サブユニットをイミュノブロット法で定性的に高感度で検出する方法である。

高速液体クロマトグラフィーにより切断した合成ペプチドを分画する活性の定量法これは、レグマチュレインをアスパラギン残基を含む合成ペプチドに作用させた後、高速液体クロマトグラフィーに接続した逆相カラムを用いて、基質と生成したペプチドを分離し、その切断活性を定量する方法である。

しかしながら、の方法は、比較的多くのサンプルを1度に測定することができ、感度も非常に高いという長所を有しているが、活性の検出に丸1日程度の時間を要し、迅速な測定法とは言えない。また、の方法も、1サンプルあたり30分程度の時間を必要とする。さらに、およびの方法では、試料にレグマチュレイン以外のプロテアーゼ等が含まれる場合、正確な測定が困難であった。したがって、上記従来のレグマチュレイン活性測定法は、その操作性及び迅速性等の点で問題があった。

産業上の利用分野



本発明は、植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法に関し、詳しくは特定の構造を有する消光性蛍光基質を利用した、植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼの活性を迅速に定量する方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
アミノ酸配列中にアスパラギン残基を少なくとも1つ有すると共に、アスパラギン残基のC-末端側がイソロイシン残基、ロイシン残基及びバリン残基のいずれでもない、配列表の配列番号1~6のいずれかに記載のオリゴペプチドであって、7-メトキシクマリン-4-yl-アセチル基をN-末端側に、2,4-ジニトロフェニル基をC-末端側に配した消光性蛍光基質を用いて、アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼにより切断された消光性蛍光基質から生ずる蛍光を測定することを特徴とする植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法。

【請求項2】
消光性蛍光基質が、配列表の配列番号1~6のいずれかに記載のオリゴペプチドであって、7-メトキシクマリン-4-yl-アセチル基をN-末端側のグリシン残基のアミノ基に、2,4-ジニトロフェニル基をC-末端側から3番目のリジン残基のε-アミノ残基に配した消光性蛍光基質である請求項記載の迅速定量法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 登録


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