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遺伝子導入法

国内特許コード P04A005191
掲載日 2005年1月11日
出願番号 特願平09-093202
公開番号 特開平10-262666
登録番号 特許第3151657号
出願日 平成9年3月26日(1997.3.26)
公開日 平成10年10月6日(1998.10.6)
登録日 平成13年1月26日(2001.1.26)
発明者
  • 小沢 憲二郎
  • 大川 安信
  • 石毛 光雄
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 遺伝子導入法
発明の概要 【課題】 長鎖DNAを植物細胞内に導入することが可能であり、適用可能な植物の範囲が広く、かつ簡便な遺伝子導入法を提供することを課題とする。
【解決手段】 ポリエチレングリコール法において、ポリエチレングリコールと反応させるDNA濃度を高めることにより、長鎖DNAを高効率で植物細胞内に導入することに成功した。
従来技術、競合技術の概要


細胞内に外来遺伝子を導入する技術、即ち、形質転換技術は、導入遺伝子の機能の解析、組み換えタンパク質の生産、遺伝子治療、有用形質転換植物の作出などに用いられる遺伝子工学分野における基本的な技術である。
植物細胞の形質転換技術としてこれまでに、電気パルスによりDNAを導入する電気的穿孔法, 植物腫瘍を引き起こす土壌細菌であるアグロバクテリウムによる感染を利用するアグロバクテリウム法、DNAを吸着させた弾丸を細胞に撃ち込むマイクトプロジェックタイルボンバードメント法、融合剤であるポリエチレングリコールをDNAに結合させエンドサイトーシス様過程(推定)によりDNAを細胞内に取り込ませるポリエチレングリコール法などが開発されてきた。
しかし、上記の方法では25kb以上の巨大DNAを細胞内に導入することが不可能であり(CAROL M.et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 p9975(1996))、例えば、RFLP(restriction fragment length polymorphis)マーカー利用により作られた遺伝子地図を用いたマップベースの遺伝子の単離やクローニングなどに上記の形質転換法を適用することは困難であった。
このため長鎖DNAを細胞内へ導入するために上記の形質転換法の改良などが行われ、近年になりアグロバクテリウム法およびマイクトプロジェックタイル法について植物細胞への長鎖DNAの導入について成功例が報告された(CAROL M.et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 9975~9979(1996)、Joyce M.et al.Plant Cell Reports.14 299~304(1995))。
しかしながら、アグロバクテリウム法には、導入する外来遺伝子を挿入するベクター系が限定されており、また適用できない植物種があるという問題点があり、一方、マイクトプロジェックタイル法には装置が高額でありまた導入効率が低いという問題点があった。
なお、純化したDNAさえあれば簡便に行うことができ、しかも特に適用可能な植物種に制限のないという特徴を有し、利用頻度が高いポリエチレングリコール法については長鎖DNAの導入についての報告例は皆無である。

産業上の利用分野


本発明は遺伝子工学の分野、特に植物細胞への遺伝子の導入法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
長鎖DNAをプロトプラストに導入する方法であって、(a)プロトプラスト懸濁液、ポリエチレングリコールおよび長鎖DNAを、長鎖DNAの終濃度が50μg/ml以上になるように混合する工程、(b)プロトプラストを収穫し、洗浄し、培地中で培養する工程、(c)形質転換細胞を選抜する工程、を含む方法。

【請求項2】
長鎖DNAをプロトプラストに導入する方法であって、(a)プロトプラスト懸濁液、ポリエチレングリコールおよび長鎖DNAを、長鎖DNAの終濃度が100μg/ml以上になるように混合する工程、(b)プロトプラストを収穫し、洗浄し、培地中で培養する工程、(c)形質転換細胞を選抜する工程、を含む方法。

【請求項3】
プロトプラストを収穫し、洗浄し、培地中で培養する工程におけるプロトプラストの洗浄において、静置および/または緩やかな撹拌により沈殿したDNAを溶解させプロトプラストを懸濁させることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
長鎖DNAが100kb以上のDNAである、請求項1~3のいずれかに記載の方法。

【請求項5】
プロトプラストが単子葉植物由来である、請求項1~3のいずれかに記載の方法。

【請求項6】
単子葉植物がイネ科植物である、請求項5に記載の方法。

【請求項7】
イネ科植物がイネである、請求項6に記載の方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 登録


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