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プロモーター

国内特許コード P04A005201
掲載日 2005年1月11日
出願番号 特願平10-196343
公開番号 特開2000-023672
登録番号 特許第2981549号
出願日 平成10年7月10日(1998.7.10)
公開日 平成12年1月25日(2000.1.25)
登録日 平成11年9月24日(1999.9.24)
発明者
  • 長谷部 亮
  • 富山 雅光
  • 阿久津 克己
出願人
  • 農林水産省農業生物資源研究所長
発明の名称 プロモーター
発明の概要 細菌用プロモータートラップベクターおよびこのベクターを用いて細菌プロモーターを提供すること。制限酵素部位を有する配列、細菌のリボゾーム結合部位配列、およびGFPをコードする配列をこの順に有するベクターを作成する。この制限酵素部位に細菌の染色体を挿入し、GFPの発現をUVで検出する。このベクターでErwinia ananas株のプロモーターを取得する。このErwinia ananas株のプロモーターを用いて効率的な生物的防除剤が製造される。
従来技術、競合技術の概要 植物の地上部病害を植物の葉面に棲息する細菌(葉面細菌)により防御すること、すなわち生物的防除(バイオコントロール)は、古くから関心がもたれているテーマであり、これまで多くの研究成果が発表されてきた。しかし、室内実験では効果が認められるが、圃場レベルでは期待した効果が得られない事例が多く、実用化段階に到達したものはほとんどない。近年、遺伝子組換え技術を利用して葉面細菌に外来遺伝子を組み込んでより効果的な生物防除微生物剤を開発しようという試みが進められている。ところで、これまで葉面細菌を宿主として組換え微生物を取得する場合において、外来遺伝子発現のスイッチであるプロモーター配列についてあまり考慮されず、主に大腸菌由来のプロモーター配列が利用されてきた。このため組換え葉面細菌では、外来遺伝子を発現させるプロモーターが十分に機能せず、結果的に外来遺伝子の発現量が不十分であるのではないかと指摘されていた。そこで、より精巧かつ効果的な組換え生物防除微生物剤を作出するために、宿主となる葉面細菌由来のプロモーターの探索が望まれている。プロモーターの探索法としては、トランスポゾンを利用する方法とトラップベクターを利用する方法とに大きく分けることができる。トランスポゾンを利用してプロモーターを探索する方法は、以下の通りである。まず、トランスポゾンの内部にプロモーターを欠如させたレポーター遺伝子を挿入する。ついで、このプロモーターの欠如したレポーター遺伝子を有するトランスポゾンを、自殺プラスミドを介して目的とする宿主細菌に導入すると、トランスポゾン変異によりこのトランスポゾンが宿主細菌のゲノムに挿入される。トランスポゾンが、宿主のゲノムのプロモーター領域の下流に挿入されると、この宿主ゲノムのプロモーター(内在性のプロモーター)の働きでレポーター遺伝子が発現するので、発現したレポーターを探索することにより、プロモーターの下流にレポーター遺伝子が挿入されたクローンを選抜することができる。ついで、このプロモーター遺伝子を単離することができる。しかしながら、このトランスポゾンを用いる探索方法には、上記クローンからプロモーター遺伝子を単離するために、宿主細菌の全ゲノムDNAライブラリーからこのトランスポゾンをプローブとして、プロモーターを含むクローンを別途選抜しなければならないという煩雑さがある。他方、トラップベクター法は、まず、プロモーターを欠如させたレポーター遺伝子が組み込まれたベクターを用意し、このベクターのレポーター遺伝子の上流に宿主全ゲノムDNA断片をショットガンクローニングして、組換えプラスミドを得、ついで、得られた組換えプラスミドを宿主細菌に形質転換し、宿主細菌中でレポーター遺伝子の発現を解析する方法である。宿主ゲノムのDNA断片にプロモーター活性があるとレポーターが発現するので、プロモーター活性を有するクローンを簡単に選抜することができ、プロモーター配列の単離も容易である。上記のように、トランスポゾンを用いる方法およびトラップベクターを用いる方法のいずれの方法においても、レポーター遺伝子が用いられる。レポーター遺伝子としては、これまでにテトラサイクリンやクロラムフェニコール等の抗生物質耐性遺伝子の他に、β-グルクロニダーゼ(GUS)、β-ガラクトシダーゼ(lacZ)、ルシフェラーゼ(lux)等の発色・発光遺伝子が利用されてきた。しかし、これらはすべて酵素であるため、酵素反応のための基質を別途添加する必要があるという欠点がある。また、目的とする宿主微生物にもともと抗生物質耐性や類似酵素活性がある場合には、これらレポーター遺伝子を用いることができないという欠点もあった。最近、これらの欠点を補う新しいレポーター遺伝子として、GFP(Green Fluorescent Protein)が注目を集め、利用されるようになってきた。GFPは発光クラゲのもつ発光タンパクであり、このタンパクが蓄積すると紫外線照射下で緑色に発色する。このGFP遺伝子をレポーター遺伝子とする動物細胞用のプロモータートラップベクターが市販されている(例えば、クローンテック(CLONTECH)社が市販しているpEGFP-1)。しかし、これらのベクターは、動物用であるため、細菌のプロモーターをトラップするために用いることはできない。このように、未だ、細菌のプロモーターを効率よく探索するためのベクターは知られておらず、細菌のプロモーターをどのようにして探索し、利用するかについては、ほとんど知られていないのが実情である。そこで、細菌のプロモーターを効率よく探索するためのベクター、および細菌のプロモーターを提供することが望まれていた。
産業上の利用分野 細菌のプロモーターを探索するためのプロモータートラップベクター、およびこのベクターを用いる細菌プロモーターの探索方法。また、Erwinia属に属する細菌に由来するプロモーター。
特許請求の範囲 【請求項1】 配列表の配列番号1の第101番目から第171番目の配列を有するプロモーター。
【請求項2】 前記配列が、配列表の配列番号1の配列である請求項1に記載のプロモーター。
【請求項3】 配列表の配列番号2の第168番目から第227番目の配列を有するプロモーター。
【請求項4】 前記配列が、配列表の配列番号2の配列である請求項3に記載のプロモーター。
【請求項5】 配列表の配列番号3の配列を有するプロモーター。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 権利存続中


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