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ネオスポーラ感染判別方法

国内特許コード P04A005284
掲載日 2005年1月11日
出願番号 特願平10-317776
公開番号 特開2000-146979
登録番号 特許第3016021号
出願日 平成10年11月9日(1998.11.9)
公開日 平成12年5月26日(2000.5.26)
登録日 平成11年12月24日(1999.12.24)
発明者
  • 清水 眞也
  • 山根 逸郎
  • 國保 健浩
  • 衛藤 真理子
  • 志村 亀夫
  • 播谷 亮
  • 浜岡 隆文
  • 猪島 康雄
出願人
  • 農林水産省家畜衛生試験場長
発明の名称 ネオスポーラ感染判別方法
発明の概要 以下の工程(a)~(e)を含むことを特徴とするネオスポーラ感染判別方法である。(a)ネオスポーラ抗原を固相に固定化した後、余剰のネオスポーラ抗原を除去する工程(b)前記固相にホニュウ類以外の生物由来の抗体を加えた後、余剰の抗体を除去する工程(c)前記固相に対象動物の血清を加えた後、抗原抗体複合体以外の物質を除去する工程(d)前記抗原抗体複合体を標識プロテインAGを利用して検出する工程(e)前記抗原抗体複合体の存在の有無により、対象動物の血清中のネオスポーラ抗原に対する抗体の有無を判別し、これによって対象動物のネオスポーラ感染の有無を判別する工程。 対象動物のネオスポーラ感染の有無を精度よく判別できる。
従来技術、競合技術の概要 ネオスポーラ(Neospora cuninum)は1988年に確認された新種の原虫であり、多種の哺乳動物(牛、犬、山羊、羊、馬、鹿等)へ感染することが報告されている。哺乳動物にネオスポーラが感染すると、犬では感染すると成犬、幼犬ともに神経症状を呈する。成牛では通常感染しても症状は認められない。しかし、母牛では死産、流産が発生し、また、虚弱児あるいは神経症状を伴った新生児の出産が発生する。ネオスポーラによる牛における死産、流産は妊娠中期に起こるため搾乳牛においては、出産後の牛乳の生産は不可能となる。また、幼牛の死流産は、肉牛および乳牛の生産計画を大きく狂わし、畜産経営に大きな被害を与える。死流産の原因としては、ウイルスが大きく関与していると考えられているが、ネオスポーラに起因する例も相当数存在すると考えられている。従って、ネオスポーラ感染の有無を判別することは、畜産業等において非常に重要である。ネオスポーラの感染経路としては、胎盤感染が報告されているが、胎盤感染以外の感染経路は現在のところ不明である。従って、現時点では、ネオスポーラに感染した母動物の摘発が、ネオスポーラ感染を予防する有効な手段であると考えられている。対象動物がネオスポーラに感染しているか否かは、一般的に、対象動物の血清中にネオスポーラに対する抗体が存在しているか否かにより判別され、その判別手法として間接蛍光抗体法、ELISA法等が用いられている。ELISA法を用いた判別方法は、一般的に以下の方法により行われている。ネオスポーラを捕捉用免疫反応体として固相に固定化した後、これに対象動物の血清を加え、ネオスポーラとネオスポーラに対する抗体とを反応させて抗原抗体複合体を形成させる。抗原抗体複合体以外の物質を洗い流した後、抗原抗体複合体中のネオスポーラに対する抗体に結合し得る酵素標識2次抗体を加え、抗原抗体複合体と酵素標識2次抗体とを結合させる。未反応の酵素標識2次抗体を洗い流した後、酵素の基質を加え、酵素と基質とを反応させる。反応による吸光度の変化によって抗原抗体複合体の存在の有無を確認する。その結果、抗原抗体複合体が存在する場合には、対象動物の血清中にネオスポーラに対する抗体が存在していること、すなわち、対象動物がネオスポーラに感染していることが明らかとなり、一方、抗原抗体複合体が存在しない場合には、対象動物の血清中にネオスポーラに対する抗体が存在しないこと、すなわち、対象動物がネオスポーラに感染していないことが明らかとなる。しかし、上記ELISA法においては、被検血清或いは酵素標識2次抗体が非特異的反応を起こし、ネオスポーラ未感染の対象動物の血清(陰性血清)が擬陽性を示すことが多く、対象動物のネオスポーラ感染を明確に判別することが困難であった。なお、このような被検血清或いは酵素標識2次抗体の非特異的反応の原因は、現在のところ特定されていない。このような状況の下、CI ELISA法(競合法によるエライサ法)、全原虫体を抗原として用いたELISA法、組換え抗原を利用したELISA法、ISCOM ELISA法、カイネティックELISA法等の、反応特異性を高めた種々のELISA法が報告されている。しかし、これらの方法によっても十分な特異反応が得られない場合が多く、また、十分な特異反応が得られる場合であっても、ELISA法の特色である簡便性、高感度等の利点が失われ、実用性に乏しいものとなっている。従って、現時点においては、非特異的反応が起こるため判別に熟練を要し、さらに判別に主観が入るため結果の統一性がない等の問題があるものの、間接蛍光抗体法がネオスポーラ感染の血清判別方法の標準的手法となっている。そこで、対象動物のネオスポーラ感染の有無を精度よく判別でき、かつ操作も簡便であるネオスポーラ感染判別方法の開発が切望されている。
産業上の利用分野 ネオスポーラ感染判別方法
特許請求の範囲 【請求項1】 以下の工程(a)~(e)を含むことを特徴とするネオスポーラ感染判別方法。(a)ネオスポーラ抗原を固相に固定化した後、余剰のネオスポーラ抗原を除去する工程(b)前記固相にホニュウ類以外の生物由来の抗体を加えた後、余剰の抗体を除去する工程(c)前記固相に対象動物の血清を加えた後、抗原抗体複合体以外の物質を除去する工程(d)前記抗原抗体複合体を標識プロテインAGを利用して検出する工程(e)前記抗原抗体複合体の存在の有無により、対象動物の血清中のネオスポーラ抗原に対する抗体の有無を判別し、これによって対象動物のネオスポーラ感染の有無を判別する工程
産業区分
  • 試験、検査
  • 微生物工業
  • 治療衛生
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 権利存続中


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