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非天然蛋白質の製造方法、固定化方法及びキット コモンズ 新技術説明会

国内特許コード P04A005404
整理番号 GI-H14-19
掲載日 2005年1月18日
出願番号 特願2003-057476
公開番号 特開2004-261160
登録番号 特許第3896460号
出願日 平成15年3月4日(2003.3.4)
公開日 平成16年9月24日(2004.9.24)
登録日 平成19年1月5日(2007.1.5)
発明者
  • 西川 一八
  • 鈴木 正昭
  • 横川 隆志
  • 細谷 孝充
  • 大野 敏
出願人
  • 国立大学法人岐阜大学
発明の名称 非天然蛋白質の製造方法、固定化方法及びキット コモンズ 新技術説明会
発明の概要

【課題】生理活性の低下を抑えつつ非天然アミノ酸を高効率で部位特異的に組込むのが容易な非天然蛋白質の製造方法、その製造方法により製造された非天然蛋白質、及び生理活性の低下を抑えつつ部位特異的に非天然蛋白質を固定化するのが容易な非天然蛋白質の固定化方法を提供する。
【解決手段】非天然蛋白質は非天然アミノ酸が組込まれたものである。第1の非天然蛋白質は、チロシンアナログ、サプレッサーtRNA及びチロシルtRNA合成酵素変異体を含有する蛋白質合成系に鋳型を加えて蛋白質合成させることにより製造される。チロシンアナログは化1又は化2に示されるものが用いられる。第2の非天然蛋白質は第1の非天然蛋白質に組込まれたチロシンアナログの置換基R1又はR2を狙って修飾物を結合させることにより製造される。固定化方法は前記修飾物を固定化担体に変更することにより行われる。
【化1】

R1はアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基。
【化2】

R2はアジド基、アセチル基又はアミノ基。
【選択図】 なし

従来技術、競合技術の概要
従来より、この種の非天然蛋白質の製造方法としては、例えば、非天然型アミノ酸組込み蛋白質とその製造法及び試薬キットが知られている(特許文献1参照)。この製造法は、無細胞蛋白質合成系下で、特定のアミノ酸に対応するアイソアクセプティングtRNAのうち、一部のもののみを非天然型アミノ酸と結合させたものと、蛋白質構成アミノ酸とを用いて蛋白質合成を行って、非天然型アミノ酸を特定のコドングループに組込むものである。また、前記非天然型アミノ酸は、a.天然型アミノ酸中の原子を安定同位体で置換したもの、b.天然型アミノ酸中の原子を放射性同位体で置換したもの、c.天然型アミノ酸の側鎖の光学異性体、d.天然型アミノ酸の側鎖に置換基を導入したもの、e.天然型アミノ酸の側鎖を置換して疎水性、反応性、蛍光性、荷電状態、分子の大きさ、水素結合能を変化させたもの、等が挙げられる。
【0003】
一方、従来より、蛋白質のX線結晶構造解析には、例えば非特許文献1に開示されている方法により製造されたセレノメチオニン置換タンパク質が用いられている。このセレノメチオニン置換タンパク質を製造する際には、まず、大腸菌のメチオニン要求株と目的タンパク質の遺伝子が挿入されているプラスミドを準備して形質転換を行った後、抗生物質を含むアガロースゲルプレートを用いて目的タンパク質を発現する単一コロニーを単離する。次に、単離された形質転換体をメチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む培地中で培養することにより目的タンパク質を発現させて精製する。
【0004】
【特許文献1】
特許第3317983号公報
【非特許文献1】
清水敏之、岡田健吾、箱嶋敏雄、第17章 X線結晶構造解析 セレノメチオニン置換タンパク質の発現と調製、「基礎生化学実験法3 タンパク質I.検出・構造解析法」、株式会社東京化学同人、第1版第1刷 2001年2月15日、p.189-190。
産業上の利用分野
この発明は、生物が普遍的に利用する20種類のL-α-アミノ酸に存在しない側鎖を持つ非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれた非天然蛋白質を製造する非天然蛋白質の製造方法、及びその非天然蛋白質を固定化する非天然蛋白質の固定化方法及びその非天然蛋白質の製造用キットに関するものである。
特許請求の範囲 【請求項1】 非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれた非天然蛋白質を製造する方法であって、
チロシンアナログと、サプレッサーtRNAと、前記チロシンアナログをサプレッサーtRNAに結合させるアミノアシルtRNA合成酵素変異体とを含有する蛋白質合成系に、鋳型を加えて蛋白質合成させる蛋白質合成工程及び該蛋白質合成工程後の後修飾工程を含み、
前記チロシンアナログはアジドチロシン、アセチルチロシン、アミノチロシン又はドーパであり、
前記鋳型は前記サプレッサーtRNAが認識する終止コドンを翻訳領域に配したポリヌクレオチドであり、
前記後修飾工程は、前記チロシンアナログの側鎖のアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基を修飾して蛍光物質を含む修飾物を結合させることにより前記チロシンアナログを蛍光性チロシンアナログ修飾体にする工程であることを特徴とする非天然蛋白質の製造方法。
【請求項2】 前記チロシンアナログはアジドチロシンであり、前記修飾物は蛍光物質と該蛍光物質に結合されたトリアリールホスフィン誘導体であって、蛍光物質とトリアリールホスフィン誘導体とを結合させ、その結合された修飾物を前記アジド基に結合させることを特徴とする請求項1に記載の非天然蛋白質の製造方法。
【請求項3】 前記アミノアシルtRNA合成酵素変異体を酵母(Saccharomyces cerevisiae)のチロシルtRNA合成酵素変異体とするとともに、 前記サプレッサーtRNAを酵母(Saccharomyces cerevisiae)のナンセンスサプレッサーtRNATyrとしたことを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の非天然蛋白質の製造方法。
【請求項4】 非天然アミノ酸が部位特異的に組み込まれた非天然蛋白質を製造する方法であって且つチロシンアナログと、サプレッサーtRNAと、前記チロシンアナログをサプレッサーtRNAに結合させるアミノアシルtRNA合成酵素変異体とを含有する蛋白質合成系に、鋳型を加えて蛋白質合成させる蛋白質合成工程を含み、前記チロシンアナログはアジドチロシン、アセチルチロシン、アミノチロシン又はドーパであり、前記鋳型は前記サプレッサーtRNAが認識する終止コドンを翻訳領域に配したポリヌクレオチドであることを特徴とする非天然蛋白質の製造方法により製造された非天然蛋白質を、支持体とその支持体に結合した反応基とを備えた固定化担体に固定化する方法であって、
前記チロシンアナログの側鎖のアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基を前記反応基に対して結合させることを特徴とする非天然蛋白質の固定化方法。
【請求項5】 請求項1に記載の非天然蛋白質の製造方法に用いられる非天然蛋白質の製造用のキットであって、
前記チロシンアナログと、前記アミノアシルtRNA合成酵素変異体と、前記蛍光物質を含む修飾物とを備えていることを特徴とするキット。
産業区分
  • 微生物工業
  • 有機化合物
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 権利存続中
岐阜大学産官学連携推進本部では、岐阜大学における知的財産の創出・管理・活用のマネジメントをしています。上記の特許・技術に関心のある方は、下記問い合わせ先に整理番号とともにご相談下さい。


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