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凍結保護物質の調製方法 新技術説明会 実績あり

国内特許コード P04A005906
整理番号 KANDAI-12
掲載日 2005年2月1日
出願番号 特願2000-059444
公開番号 特開2001-139599
登録番号 特許第4334719号
出願日 平成12年3月3日(2000.3.3)
公開日 平成13年5月22日(2001.5.22)
登録日 平成21年7月3日(2009.7.3)
優先権データ
  • 特願1999-240928 (1999.8.27) JP
発明者
  • 小幡 斉
  • 河原 秀久
  • 山出 和弘
  • 小村 啓悟
  • 金子 昌二
  • 坂本 紀子
出願人
  • 学校法人 関西大学
発明の名称 凍結保護物質の調製方法 新技術説明会 実績あり
発明の概要 【課題】 比較的低濃度の添加量で代謝系酵素などのタンパク質の凍結変性を防止することのできる、微生物由来の凍結保護物質と、この物質の製造方法並びにこの物質の利用発明を提供する。
【解決手段】 Erwinia(=Pantoea)属またはXanthomonas属に属する微生物が産生する凍結保護物質、前記微生物を30℃以下の温度で培養することにより凍結保護物質の発現を誘導させ、その培養物中から凍結保護物質を取得することを特徴とする凍結保護物質の製造方法、並びに、この凍結保護物資を用いたタンパク質および生物材料の安定化/保存方法。
従来技術、競合技術の概要
タンパク質や細胞、微生物、あるいは動物臓器等を長期間にわたって保存するためには、これらを凍結する手段が採られている。しかしながら、一般に、タンパク質を凍結させるとその高次構造が変化すること(以下、この変化を「凍結変性」と記載する)が知られており、凍結変性が起こるとそのタンパク質は失活し、融解後に本来の機能を回復できない。
【0003】
従来、このようなタンパク質の凍結変性を防止する方策としては、グルコース、ショ糖、トレハロース、ソルビトールなどの糖類や、グリセリンや、アルブミンなどを添加することが知られており、これらを添加することにより、凍結時にタンパク質の凍結変性を防止し、融解後にそのタンパク質の本来の機能を回復させることができる。このため、これらの物質の溶液は、例えば、血液、臓器、酵素などの保存液として用いられている。
産業上の利用分野
この出願の発明は、代謝系酵素などのタンパク質の凍結変性を防止することができる凍結保護物質の調製方法に関するものである。
特許請求の範囲 【請求項1】 パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)を、20~40℃で前培養した後、5℃~18℃、10~96時間低温培養し、低温培養後の菌体内の物質を、硫酸アンモニウムで塩析し、硫酸アンモニウムでの塩析後の画分を、第4級アンモニウム基を有する陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて活性画分を溶出させ、溶出された活性画分を吸着クロマトグラフィーにかけてさらに活性画分を溶出させ、溶出された活性画分をゲルろ過クロマトグラフィーにかけてさらに活性画分を溶出させ、溶出された活性画分を疎水性クロマトグラフィーにかけてさらに活性画分を溶出させ、溶出された活性画分を分取して、分子量29000Da(ゲル濾過クロマトグラフィーによる測定、及びSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定)の単量体からなる凍結保護物質を精製することにより得られる凍結保護物質を、0.01~1μg/mlの濃度に調製することを特徴とする凍結保護物質の調製方法。
【請求項2】 析を、飽和度60~80%の硫酸アンモニウムによって行う請求項記載の凍結保護物質の調製方法。
【請求項3】 イオン交換クロマトグラフィーによる精製工程において、リン酸カリウム緩衝液と塩化ナトリウムにより、塩化ナトリウムの濃度勾配溶出法で活性画分を溶出させる請求項1又は2記載の凍結保護物質の調製方法。
【請求項4】 着クロマトグラフィーによる精製工程において、リン酸カリウム緩衝液の濃度勾配溶出法で活性画分を溶出させる請求項1乃至3のいずれかに記載の凍結保護物質の調製方法。
【請求項5】 ルろ過クロマトグラフィーによる精製工程において、塩化ナトリウムを含むリン酸カリウム緩衝液で溶出させる請求項1乃至4のいずれかに記載の凍結保護物質の調製方法。
【請求項6】 水性クロマトグラフィーによる精製工程において、リン酸カリウム緩衝液と硫酸アンモニウムにより、硫酸アンモニウムの濃度勾配溶出法で活性画分を溶出させる請求項1乃至5のいずれかに記載の凍結保護物質の調製方法。
産業区分
  • 有機化合物
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
画像

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出願権利状態 権利存続中
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