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特性を改変した蛋白質の作出方法

国内特許コード P04A005939
整理番号 化学・薬品-111
掲載日 2005年2月16日
出願番号 特願2002-305896
公開番号 特開2004-135630
登録番号 特許第4168135号
出願日 平成14年10月21日(2002.10.21)
公開日 平成16年5月13日(2004.5.13)
登録日 平成20年8月15日(2008.8.15)
発明者
  • 林 清
  • ボン ジョ キム
  • 韮澤 悟
  • 北岡 本光
出願人
  • 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 特性を改変した蛋白質の作出方法
発明の概要

【課題】断片化され、活性を有していない蛋白質の2種類以上を共存させ、リフォールディングすることにより活性型の蛋白質、すなわち特性の改変された蛋白質を得る方法を開発すること。
【解決手段】2種類以上の断片化蛋白質を共存させ、共存リフォールディングすることを特徴とする特性を改変した蛋白質の作出方法。
【選択図】 なし

従来技術、競合技術の概要
これまで、蛋白質(酵素)の特性を改変することは、非常に困難であった。一部には、遺伝子レベルで改変する手法(非特許文献1)もあるが、「蛋白質(酵素)を構成する数百のアミノ酸残基のうち、どのアミノ酸残基をどのように変換すれば、所望する改変活性を有する酵素が得られるか」、といった予測手法がほとんど見あたらないことから、遺伝子レベルでの蛋白質(酵素)改変には多大な時間と労力を要した(非特許文献2)。
一方、複数酵素を対象にその遺伝子を置換し、キメラ遺伝子を構築し、得られたキメラ遺伝子を発現することにより、両親酵素とは異なった特性を有するキメラ酵素を取得する技術も開発されている(非特許文献3)。しかし、この方法では、遺伝子置換を一つずつ実施する必要があり、容易ではない。
また、蛋白質を人為的に断片化し、得られた断片化蛋白質を混合し、共存リフォールディングにより活性型の蛋白質(酵素)を得ることは、試みられていなかった。
【0003】
【非特許文献1】
生物化学実験法40、「蛋白質工学研究法」、井本泰治著、学会出版センター発行、「変異蛋白質の調製」p55-70、ISBN4-7622-9822-0(1996)
【非特許文献2】
ゲノム微生物学、木村 光編、シュプリンガー・フェアラーク発行、「8.蛋白質工学」、p181-196、ISBN4-431-70840-5(1999)
【非特許文献3】
K. Hayashi et al., J. Mol. Cat. B: Enzym., vol.11,p811-816(2001)
産業上の利用分野
本発明は、特性を改変した蛋白質の作出方法に関する。詳しくは、2種類以上の不活性な断片化蛋白質を混合し、混合状態のままリフォールディングさせることにより、特性を改変した活性型蛋白質を作出する方法に関する。
特許請求の範囲 【請求項1】 2種類以上の断片化β-グルコシダーゼを共存させ、5~7M 塩酸グアニジンもしくは6~9M 尿素、10~50mM 緩衝剤、0.01~10mM 還元剤、0.01~10mM 酸化剤、0.01~1mM タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液(pH6~10)を用いて4~30℃で共存リフォールディングすることを特徴とする、至適pH、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Kcat値およびKm値から選ばれた少なくとも1種の特性を改変したβ-グルコシダーゼの作出方法。
【請求項2】 異なる生物種由来の2種類以上の断片化β-グルコシダーゼを共存させ、5~7M 塩酸グアニジンもしくは6~9M 尿素、10~50mM 緩衝剤、0.01~10mM 還元剤、0.01~10mM 酸化剤、0.01~1mM タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液(pH6~10)を用いて4~30℃で共存リフォールディングする、至適pH、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Kcat値およびKm値から選ばれた少なくとも1種の特性を改変したβ-グルコシダーゼの作出方法。
【請求項3】 同一生物種由来の2種類以上の断片化β-グルコシダーゼを共存させ、5~7M 塩酸グアニジンもしくは6~9M 尿素、10~50mM 緩衝剤、0.01~10mM 還元剤、0.01~10mM 酸化剤、0.01~1mM タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液(pH6~10)を用いて4~30℃で共存リフォールディングする、至適pH、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Kcat値およびKm値から選ばれた少なくとも1種の特性を改変したβ-グルコシダーゼの作出方法。
【請求項4】 3~100種類の断片化β-グルコシダーゼを共存させることを特徴とする請求項1~3のいずれかに記載の作出方法
【請求項5】 同一のβ-グルコシダーゼ由来の2種類以上の断片化β-グルコシダーゼを共存させ、5~7M 塩酸グアニジンもしくは6~9M 尿素、10~50mM 緩衝剤、0.01~10mM 還元剤、0.01~10mM 酸化剤、0.01~1mM タンパク質分解酵素阻害剤および安定剤を含む変性溶液(pH6~10)を用いて4~30℃で共存リフォールディングすることによる、β-グルコシダーゼの至適pH、至適温度、熱安定性、塩による阻害効果、Kcat値およびKm値から選ばれた少なくとも1種の特性を改変する方法。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 権利存続中


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