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高能率ゲノム走査法

国内特許コード P04A006063
整理番号 測定・分析-58
掲載日 2005年2月16日
出願番号 特願2001-525196
登録番号 特許第3573130号
出願日 平成12年9月22日(2000.9.22)
登録日 平成16年7月9日(2004.7.9)
国際出願番号 JP2000006512
国際公開番号 WO2001022074
国際出願日 平成12年9月22日(2000.9.22)
国際公開日 平成13年3月29日(2001.3.29)
優先権データ
  • 特願1999-271462 (1999.9.24) JP
発明者
  • 川崎 信二
  • 小松田 隆夫
  • 間野 吉郎
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 高能率ゲノム走査法
発明の概要 小型ゲルを利用する核酸の電気泳動装置を利用することにより、従来法と比較して、顕著に高効率で多型バンドを検出しうることを見出し、さらに、該方法が遺伝分析や生物系統の識別などに好適に利用し得ることを見出した。
従来技術、競合技術の概要


生物の品種等の間での違いを核酸レベルで検出しようとする際、これまではRFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)法やRAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNAs)法等の手法が主として用いられてきた。しかしながら、RFLP法は、多量のDNA試料を必用とする上に、特定遺伝子近傍のマーカーを検索するためにはその生物に対する既存のRFLPマーカーを基に作製したゲノム地図が不可欠である。しかも、この地図の作製には長い時間と膨大なコストと人員とが必用であり、十分な密度でRFLPマーカーを持った遺伝子地図を備える生物は極めて限られている。一方、RAPD法による多型の検出は、比較的多数の試料に対応しやすいが、一度に安定して得られるバンドの数は数本程度と限られている。この場合に、PCRの条件を緩めて得られるバンドの数を増やそうとすると、得られる多型バンドの再現性が低下するという問題点も有する。
最近はAFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)法が一度に多数の(50-100以上の)バンドを比較でき、試料のDNAの消費量も少なく、得られるバンドの再現性も高いことから良く用いられるようになってきた。しかし、この原法は40-50cmに及ぶ大型のシークエンスゲルを用い、また、アイソトープによるオートラジオグラフによる核酸バンドの検出を行う等、多くの経験を必用とする作業である上に、使用条件が限られ、検出にも時間がかかり、かつそれほど多数の試料を分析できない(1回に数十程度)という欠点があった。
最近では、バンドを蛍光プライマーを用いたPCRと自動シークエンサーとにより、比較的簡便に検出する手法が開発されたが、この手法に用いるシークエンサーは高額(1-2千万円以上)であり、しかも、この方法による実験においては長時間に亘り、本来、遺伝子の塩基配列の決定に用いる機械を占有してしまう。さらに、この手法におけるバンドの検出は、自動シークエンサーを用いるシステムで行なわれることを前提としているため、検出後に目的のバンドを単離して解析することができない。このため、検出されたバンドを、SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)マーカーとして、特異的プライマーにより簡便に検出することができない点が大きな問題である。また、現在供給されている蛍光プライマーは、8-9種類づつで、全て組み合わせても64-81のプライマー対の組み合わせしか得ることができない。
また、ゲノム全体にわたる多型バンドを一度の検出する方法として、RLGS(Restriction Landmark Genome Scanning)法も挙げられるが、この方法においてもラジオアイソトープを用いており、微量のマーカーの検出のために数日を要する上に、1試料毎に巨大(40×30cm)なゲルや長く細いアガロースゲルを扱う必用がある。このため、この方法では腕力と十分な経験とを必用とする。また、この方法ではアガロースゲル中で核酸の制限酵素切断を行うために、大量の高額な制限酵素を用いる必用があり、高いコストがかかるという問題点も存在する。
イネのゲノム(450MB)についてRLGS法を実施する場合を例にとれば、標識部位の限定に用いる8塩基切断酵素がNot I等限られたものしか用いることができない上、1回の電気泳動で得られるドットの上限理論値が450MB÷48=13,700であり、実際は電気泳動の性質上、この1/3~1/6程度の2,000~4,000のドットしか得られない。しかも、比較すべき個体同士が別々のゲルで電気泳動されるため、泳動パターンがずれる場合が多く、相互の比較には高価な大型スキャナーと2次元泳動ソフトとが必要となる。
一方、全ゲノムをカバーする隣接クローンが互いの重複により整理、接続されたゲノムライブラリーの作製においては、初期の頃は、RFLPマップ等の既存の地図のマーカーを利用する試みがなされていた。しかしながら、高密度マップといわれるものでもせいぜい2,000程度のマーカーがあるに過ぎず、イネ程度の小さなゲノム(450MB)を持つものでも、平均200KB/バンド以上の密度でしかないため、全ゲノムをカバーするコンティグを作製するにはまばらすぎ、またこれだけの数のRFLPマーカーの検索のためには膨大な人員とコストと時間がかかる。
最近はライブラリー構成クローンを適当な制限酵素で切断した断片を高分解能のゲルで泳動して、そのパターンを全てデジタル化してデータベースとして取り込み、コンピュータ上で共通パターンを持つクローン同士を組み合わせて、全ゲノムをカバーするコンティグに組み上げる手法が良く用いられる。しかしながら、この手法においても全クローンを切断後末端を放射標識してオートラジオグラフィーを行なうという膨大な労力とコストとが必要になる。

産業上の利用分野


本発明は、多数の核酸試料を高効率で電気泳動し、目的とする核酸を検出するための方法および該方法に用いられる電気泳動装置に関する。本発明の方法は、ゲノムDNAの多型の検出、遺伝分析、遺伝子地図作製、および生物の全ゲノムを覆うコンティグないしは物理地図の作製において特に有用である。

特許請求の範囲 【請求項1】
ゲル上の特定のDNAのバンドに対応するクローンをゲノムDNAライブラリーから選択する方法であって、
(a)特定の生物のゲノムDNAライブラリーを、それぞれが該生物の1ゲノム以下のサイズの複数のサブライブラリーに分割する工程、
(b)それぞれのサブライブラリーに含まれる全クローンに対し、サブライブラリーの行、列、プレートの番号を振り付ける工程(ここで行、列、プレートをそれぞれ座標X、座標Y、座標Zとする)、
(c)全てのプレートの特定の行を示すクローン(座標Xクローン群)、全てのプレートの特定の列を示すクローン(座標Yクローン群)、および1つのサブライブラリーの特定のプレート上の全てのクローン(座標Zクローン群)をそれぞれ集めて別々にDNAを抽出して座標サンプルとし、対照として該生物から調製したゲノムDNAを用意する工程、
(d)1030cm角のゲル板を同時に複数枚装備して電気泳動を行なうことができ、かつ、ゲル板1枚当たり64以上の核酸試料を同時に電気泳動することができ、かつ、ゲルが1レーン当たり10μlの核酸試料を適用できる1mm厚の不連続緩衝液型のゲルである、電気泳動装置を用いて、座標サンプルとしたDNAと対照としたDNAとを並べて電気泳動する工程、
(e)電気泳動後のゲル上の座標サンプルとしたDNAのバンドと対照としたDNAのバンドを染色により検出する工程、
(f)対照における目的のDNAのバンドとゲル上での泳動度が一致するバンドが、座標Xクローン群、座標Yクローン群、および座標Zクローン群のそれぞれのクローン群の中のどの座標のクローンであるかを決定する工程、
(g)決定された3次元座標に対応するクローンをサブライブラリーから選択する工程、を含む方法。

【請求項2】
特定の生物の全ゲノムDNAを覆うコンティグを作成するために実施する、請求項1に記載の方法。
国際特許分類(IPC)
画像

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出願権利状態 登録


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