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昆虫細胞又は昆虫を用いた活性型ブタIL-18の生産方法

国内特許コード P04A006079
整理番号 動物バイオ-80
掲載日 2005年2月16日
出願番号 特願2000-303931
公開番号 特開2001-169785
登録番号 特許第3541216号
出願日 平成12年10月3日(2000.10.3)
公開日 平成13年6月26日(2001.6.26)
登録日 平成16年4月9日(2004.4.9)
優先権データ
  • 特願1999-284829 (1999.10.5) JP
発明者
  • 宗田 吉広
  • 森 康行
  • 下地 善弘
  • 新井 啓五
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 昆虫細胞又は昆虫を用いた活性型ブタIL-18の生産方法
発明の概要 【解決手段】 ブタ由来の特定の2種類のアミノ酸配列のいずれかからなるタンパク質、及び上記アミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ活性を有するタンパク質、並びにそれらのタンパク質をコードするDNA又はそれに相補的なDNAである。
【効果】 カスパーゼ活性を有するタンパク質、特にブタカスパーゼ-1及びブタカスパーゼ-3が提供される。
従来技術、競合技術の概要



カスパーゼ-1(Caspase-1)は、インターロイキン-1(IL-1)βの単球でのプロセシングに必要なシステインプロテアーゼとして見いだされ(N.A.Thornberry., et al., Nature, 356, 768-774)、インターロイキン-1β変換酵素(interleukin-1 beta converting enzyme(ICE))と呼ばれていた。その後、線虫のアポトーシスの実行遺伝子であるced-3とICE遺伝子の塩基配列が相同性を示すことが報告され、類似の構造を持つシステインプロテアーゼが次々に見いだされた。そこで、これらのシステインプロテアーゼの総称として「カスパーゼ(caspase)」という名が提唱された(E.S.Alnemri et al., Cell, 87, 171)。





カスパーゼ-3(caspase-3)もced-3とICE遺伝子の塩基配列に相同性を示すシステインプロテアーゼをコードする遺伝子としてヒトで見いだされ(T.Alnemri., et al., J.Biol.Chem., 269, 30761-30764)、カスパーゼカスケードの比較的下流に位置する重要な分子として知られている。





現在、種々の感染症、癌細胞あるいは化学物質によるプログラム細胞死(Programed cell death)において、カスパーゼカスケードはアポトーシスを起こすシグナル伝達の最も重要な経路と考えられている(D.W.Nicholson and N.A.Thornberry.,Trends Biochem. Sci., 22,299-306)。そのため、これらアポトーシス異常の関与する疾患の治療薬としてカスパーゼファミリーのプロテアーゼとそのインヒビターは大きなターゲットと考えられている(D.W.Nicholson, Nat.Biotechnol.,14,297-301)。





カスパーゼファミリーのタンパク質は、約40kDaの不活性型前駆体として合成され、プロセシングを受けて、分子量約10-kDaの短鎖と分子量約20-kDaの長鎖のサブユニットの重合したヘテロ4量体タンパク質として活性型となる。最近の研究により、カスパーゼ-1はIL-βばかりでなく、主にマクロファージで産生されるIL-18を活性のない前駆体から活性型に変換する酵素であること(T.Ghayur., et al., Nature, 386, 619-623, Y.Gu., et al., Science, 275, 206-209)、及びカスパーゼ-3はIL-18を活性型から活性のない変性産物へと変換する役割も果たすことが明らかとなった(K.Akita et al., J.Biol.Chem.,272, 26595-26603)。そのため、IL-1βの関与する様々な炎症反応、及びIL-18の関与するTh1細胞の活性化を制御する因子としても、そのインヒビターとともに研究が進められている。





これまでに、ヒト(D.P.Cerretti et al.,Science, 256, 97-100)、マウス(M.A.Nett et al., J.immunol., 149,3254-3259)、ラット(K.M.Keane et al.,Cytokine, 7, 105-110)、イヌ(F.Okano et al.,J.interferon cytokine Res.,19, 27-32)及びニワトリ(A.L.Johnson., et al., Gene, 219, 55-62)のカスパーゼ-1遺伝子、並びにヒト(T.Alnemri., et al., J.Biol.Chem., 269, 30761-30764)、マウス(Genbank公開データU19522)、ラット(Genbank公開データU84410)及びニワトリ(Genbank公開データAF083029)のカスパーゼ-3遺伝子の全塩基配列が明らかとなっているが、ブタをはじめとする家畜のカスパーゼファミリーに属する遺伝子の報告はなされておらず、ブタをはじめとする家畜におけるウィルス感染症・細菌感染症をはじめとするアポトーシスを呈する病態の解析・予防・治療方法の開発の妨げとなっている。





また、本発明者らは、これまでにブタIL-18のcDNAをクローニングし、その前駆体蛋白質および活性型蛋白質をバキュロウィルス・昆虫細胞を用いた発現系により作製したことを報告している(Y.Muneta et al., Cytokine, 12, 566-572, 2000)。しかしながら、IL-18が分泌シグナルを持たないこと、昆虫細胞がIL-18の前駆体から活性型への成熟に必要とされるカスパーゼ-1を持たないこと、昆虫細胞がIL-18を活性型から変性産物へと分解する内在性のカスパーゼ-3様活性を持っていること等から、バキュロウィルス・昆虫細胞を用いた発現系により前駆体型ブタIL-18は効率よく培養上清中に分泌発現されるものの、活性型IL-18を効率よく分泌発現することはできなかった。

このような状況の下、ブタのカスパーゼファミリーに属する遺伝子の単離・同定が切望されている。

産業上の利用分野



本発明は、カスパーゼ活性を有するタンパク質(特にブタカスパーゼ-1及びブタカスパーゼ-3)、該タンパク質をコードするDNA、該DNAに相補的なRNA、該DNAを含む発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換された形質転換体、並びに該タンパク質に反応する抗体に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】ブタカスパーゼ-1とIL-18とを共発現することを特徴とする昆虫細胞又は昆虫であって、ブタカスパーゼ-1が、以下の(a)又は(b)に示すタンパク質である、上記昆虫細胞又は昆虫。
(a)配列番号2記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2記載のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ活性を有するタンパク質
【請求項2】請求項1記載の昆虫細胞又は昆虫を用いることを特徴とする、活性型IL-18の生産方法。
【請求項3】活性型IL-18が活性型ブタIL-18である、請求項2記載の方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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09682_25SUM.gif
出願権利状態 登録


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