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環状DNAへのランダム変異導入方法

シーズコード S100002308
掲載日 2010年10月7日
研究者
  • 藤井 亮太
  • 北岡 本光
  • 林 清
技術名称 環状DNAへのランダム変異導入方法
技術概要 環状DNAを鋳型とし、複製の忠実度を低下させる条件下でローリングサークル型増幅法によりDNAを増幅し、直鎖状DNAからなる増幅産物を得て、得られた増幅産物を用いて宿主細胞を形質転換し、細胞内で環状DNAを再構築させることにより、環状DNAへランダム変異を導入する。複製の忠実度の低下をマンガンイオンの添加により行う。宿主細胞は原核細胞又は真核細胞であり、環状DNAは宿主細胞内で独自に複製可能なプラスミド等のDNAである。環状DNAを鋳型としてローリングサークル型増幅(RCA)法により増幅して得られた直鎖状の増幅産物を用いて原核細胞宿主を形質転換すると、高い確率で環状DNAが再構築され、制限酵素やリガーゼを使用することなく環状DNAを増幅できる。また、環状DNAを鋳型とし、複製の忠実度を低下させる条件下でRCA法により増幅して得られた直鎖状の増幅産物を用いて宿主細胞を形質転換すると、環状DNAが細胞内で再構築され、制限酵素やリガーゼを使用することなく変異が導入された環状DNAを得ることができる。
画像

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研究分野
  • 分子遺伝学一般
展開可能なシーズ ローリングサークル型増幅(RCA)法を利用して環状DNAを簡便かつ迅速に増幅する方法、及び環状DNAにランダム変異を導入する方法を提供する。
この方法は、PCR法を利用する従来法のように、DNA増幅のためのプライマー設計や合成、温度条件の設定、増幅産物の制限酵素処理、ライゲーション操作を行う必要がないため、作業ステップや労力が大幅に軽減され、作業時間も従来法では3時間以上であるのに対し、10分程度で完了し、飛躍的に短縮される。従って、例えばプラスミドライブラリーなどの環状DNAからなる遺伝子ライブラリーの増幅や変異体ライブラリーの構築を簡便な操作で短時間に行うのに非常に有用である。
用途利用分野 遺伝子ライブラリー増幅、変異体ライブラリー構築、環状DNAランダム変異導入
出願特許   特許 国際特許分類(IPC)
( 1 ) 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, . 藤井 亮太, 北岡 本光, 林 清, . 環状DNAへのランダム変異導入方法. 特開2005-229950. 2005-09-02
  • C12N  15/09     
  • C12Q   1/68     

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