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外来DNA断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクター及びその作製方法

シーズコード S110007050
掲載日 2011年12月14日
研究者
  • 田中 博光
  • 冨本 和也
  • 藤田 幸輔
  • 山川 稔
技術名称 外来DNA断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクター及びその作製方法
技術概要 二本鎖の一方の鎖が、5’から3’の方向に、第一のニッキングエンドヌクレアーゼの切断部位、外来DNA断片の挿入領域、第二のニッキングエンドヌクレアーゼの切断部位、スペーサー領域を挟んでなる逆方向反復配列、及び第一の制限酵素の切断部位を含む核酸である。図の工程1~工程9は外来DNA断片の逆方向反復配列を含む組換えベクターを作製する方法を示すが、上記の核酸を、発現可能な状態で発現ベクターに挿入して、組換えベクターを作製し、第一の制限酵素とニッキングエンドヌクレアーゼ処理後に、熱処理とその後のアニーリング反応によってベクターDNAの末端がループ構造になり、さらにこのループ構造で生じているニックの部分をうめ、この中間体の挿入された外来DNA断片の末端の逆側にニックを入れるとそこから鎖置換伸長反応によって、外来DNA断片が逆方向反復配列に変換されるものである。また、複数の外来DNA断片及び複数の発現ベクターを用いて、上記の方法により、外来DNA断片由来の逆方向反復配列を含む複数の組換えベクターを作製して、DNA型RNAiライブラリーを作製することができる。
画像

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研究分野
  • 遺伝子の複製
展開可能なシーズ 大規模な長鎖DNA型RNAiライブラリーを、同一作製条件下で一回又は数回で作製することができる方法を提供する。また、長鎖DNA型RNAiライブラリーを作製する際に用いられる、核酸、組換えベクター、形質転換体などの部品を提供する。さらに、長鎖DNA型RNAiライブラリーから標的遺伝子の発現量を低下させるDNA型RNAiを評価・選抜する方法を提供する。
異なる長鎖cDNAがそれぞれ挿入された複数のプラスミドを一つのチューブ内に入れた場合、それぞれ挿入されたcDNAを一気に逆方向反復配列にすることができる。発現プラスミドに挿入されたcDNAを簡便に逆方向反復配列構造に変換でき、これを直接培養細胞でのRNAiによる目的遺伝子のノックダウン実験に用いることができる。さらに、cDNA発現プラスミドライブラリーから長鎖DNA型RNAiライブラリーの構築ができる。作製された長鎖DNA型RNAiライブラリーを用いれば、微生物、昆虫及び植物等において簡便で効率よく生命現象に関わる因子の機能的探索及び同定が可能となる。
用途利用分野 RNAiライブラリー作製用試薬、RNAiライブラリー作製キット
出願特許   特許 国際特許分類(IPC)
( 1 ) 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, . 田中 博光, 冨本 和也, 藤田 幸輔, 山川 稔, . 外来DNA断片由来の逆方向反復配列を含む組換えベクター及びその作製方法. 特開2009-225682. 2009-10-08
  • C12N  15/09     
  • C12N  15/113    
  • C12N   1/15     
  • C12N   1/19     
  • C12N   1/21     
  • C12N   5/10     
  • C12Q   1/68     
  • C12Q   1/66     

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