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新規蛍光化合物およびそれを用いた細胞内コレステロールの検出方法

シーズコード S120008030
掲載日 2012年1月18日
研究者
  • 山田 圭一
  • 穂坂 正博
  • 吉原 利忠
  • 飛田 成史
  • 片貝 良一
  • 竹内 利行
技術名称 新規蛍光化合物およびそれを用いた細胞内コレステロールの検出方法
技術概要 本発明になるダシル化AmBは図1示した化学構造式で表される化合物で、脂質膜中のコレステロールと安定な複合体を形成し、強いケイ光強度を有する。図中、nは1~5の整数、Rは炭素数1~4のアルキルを示す。この化合物は、図2に示した合成方法によって、AmBとダンシル化エチレンジアミンの反応によって合成できる。なお、nが2であり、Rがメチルである化合物以外の化合物も、原料を代えることで同様にして合成することができる。コレステロールの検出方法としては、本発明の化合物を細胞に添加し、蛍光顕微鏡などで蛍光を測定することによって、細胞内コレステロールの分布などを検出できる。検出対象の細胞の種類は特に制限されないが、コレステロールを蓄積する培養細胞が好ましい。生細胞において直接蛍光を観察してもよいし、細胞を固定化してから蛍光を観察してもよい。培養したマクロファージ細胞(RAW264.7)にAmB、ダシル化AmB、フィリピンIIIのDMSO溶液を1時間取り込ませ、蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、ダシル化AmBは細胞内に取り込まれ、フィリピンIIIよりも強い蛍光を示し、AmBのみでは蛍光は見られなかった。
画像

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研究分野
  • 化学検査
  • 生体の顕微鏡観察法
展開可能なシーズ 固定化された組織でコレステロール分布を観測するプローブとしてポリエンマクロライド系抗生物質であるフィリピンIIIが用いられてきた。しかし、生体膜の高コレステロールドメインに結合して孔をあけ細胞障害を惹起し、蛍光消光が早く、それを認識する抗体もない欠点があった。また、θ‐トキシン、コレラトキシンBなどは、細胞内オルガネラのコレステロール分布全体を観察するのには適さない欠点があった。このため、ケイ光染色や抗体染色よりも感度よく固定化細胞および生細胞中のコレステロールの検出および可視化などに用いることができるケイ光化合物の提供、並びに該化合物を用いたコレステロールの検出方法および検出キットを提供する。
アンホテリシンB(AmB)にダンシル基を導入した新規AmB誘導体は、脂質膜中のコレステロールと安定な複合体を形成できるので、細胞内のコレステロールを蛍光染色や抗体染色によって感度よく検出できる。従来品より蛍光強度が強く、免疫染色も可能であることから固定細胞及び生細胞中のコレステロールの可視化に幅広く適用できる。
用途利用分野 コレステロール検出用ケイ光化合物、コレステロール検出装置、コレステロール検出キット
出願特許   特許 国際特許分類(IPC)
( 1 ) 国立大学法人群馬大学, . 山田 圭一, 穂坂 正博, 吉原 利忠, 飛田 成史, 片貝 良一, 竹内 利行, . 新規蛍光化合物およびそれを用いた細胞内コレステロールの検出方法. 特開2009-091287. 2009-04-30
  • C07D 493/08     
  • C12Q   1/60     
  • C12Q   1/02     
  • G01N  21/78     

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