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環状二本鎖DNAおよびそれを用いたDNAの増幅方法

シーズコード S120008913
掲載日 2012年2月17日
研究者
  • 高橋 宏和
  • 杉山 滋
技術名称 環状二本鎖DNAおよびそれを用いたDNAの増幅方法
技術概要 2種の出発材料となる直鎖状二本鎖DNA断片を用意し、一方の直鎖状二本鎖DNA断片Aについて、制限酵素Xで切断した後、両末端を脱リン酸化し、制限酵素Xとは異なる制限酵素Yで切断し、他方の直鎖状二本鎖DNA断片Bについても、制限酵素Yで切断した後、両末端を脱リン酸化し、制限酵素Xで切断する。2種の直鎖状二本鎖DNA断片A、Bは両方とも、一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない状態となる。これらのDNA断片A、Bをライゲーションすると、3種類のDNA結合産物が得られ、直鎖状DNA特異的なエクソヌクレアーゼにより分解処理することによって、環状二本鎖DNAだけを得る。得られた環状二本鎖DNAは、一方の鎖にはニックがない状態、他方の鎖にはニックが2つ存在する状態になる。ニックを有する鎖におけるニック間のDNA鎖が、DNAの増幅反応において、初期プライマーとして働く。すなわち、DNAの伸張反応によってニックの位置からDNAが合成されていき、鋳型の環状二本鎖DNAの配列が、樹状構造状に10~1013回程度繰り返した配列を有するDNA増幅産物を産生する。
画像

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研究分野
  • 遺伝子の複製
展開可能なシーズ DNAを簡易な手順で特異的に増幅する方法、とくに目的となるDNAが極微量であっても特異的に増幅することができる方法を提供する。
鋳型が極微量であっても増幅効率が高く、また目的以外のDNA増幅のない極めて特異性の高いDNA増幅が、簡便な手順で短期間に行うことが可能である。さらに、鋳型のサイズが限定されず、通常の大きさのもののほか、極めて大きなサイズ(例えば、20kbpを超えるもの、数10~数1000kbpのもの、さらにそれを超えるサイズのもの)を増幅可能である。さらにまた、生物細胞を経由せずに試験管内において、任意のDNA断片を増幅することができることから、従来の方法では不可能であった大腸菌等の生体内で致死的に働く遺伝子の増幅が可能となる。また、大腸菌等の生体内で頻繁に組み換えを引き起こす配列、例えばレトロウイルス様配列の増幅も可能である。さらにまた、とくに医療用として期待の高いウイルスベクターの増幅において、生物細胞内を経由していないため、エンドトキシン等の毒性物の混入を防ぐことが可能であり、この点においても本発明は極めて有効である。
用途利用分野 DNA増幅用試薬、DNA増幅キット
出願特許   特許 国際特許分類(IPC)
( 1 ) 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, . 高橋 宏和, 杉山 滋, . 環状二本鎖DNAおよびそれを用いたDNAの増幅方法. 特開2010-051182. 2010-03-11
  • C12N  15/09     
  • C12Q   1/68     

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