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DNA合成酵素

シーズコード S130009520
掲載日 2013年6月5日
研究者
  • 土居 洋文
  • 金井 昭夫
  • 石野 良純
技術名称 DNA合成酵素
技術概要 PfuDNA合成酵素遺伝子の塩基配列に従ってPCRプライマーを合成し、Pyrococcus furiosusのゲノムDNAを鋳型とするPCRによって目的遺伝子を増幅し、これを大腸菌用の発現ベクターにクローニングした。クローン化したPfuDNA合成酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターpDPWT100に対して、期待する変異を含んだオリゴヌクレオチド(配列番号5および6)と突然変異導入キットを用い、改変型PfuDNA合成酵素Iの遺伝子を、発現ベクターpDPWT100上で作成し、発現ベクターpDP5b17を構築した。また同一の方法により、改変型PfuDNA合成酵素IIの遺伝子を作成し、発現ベクターpDP5C4を構築した。従来の野性型PfuDNA合成酵素を用いた場合には、約1000ベースに大きな合成停止領域が存在し、このことによる不完全なDNA鎖の存在を示すバンドが観察された。一方、この発明の改変型PfuDNA合成酵素IおよびIIによるDNA合成では、約1000ベースのバンドも含めて合成量が増大し、しかもより高分子の(すなわち、より伸長した)PCR産物の存在を示すバンドも観察された。
画像

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研究分野
  • 微生物酵素の生産
  • 遺伝子操作
展開可能なシーズ DNA鎖をPCR等により合成、増幅するに際して、PfuDNA合成酵素の特徴である高忠実性を維持しつつ、鋳型DNA鎖をより長く効率的に増幅することのできる新規な耐熱性DNA合成酵素を提供する。またこの発明は、このDNA合成酵素をコードするDNA配列と、このDNA配列の発現産物として上記DNA合成酵素を製造する方法を提供する。
1本鎖DNAに相補的なDNA鎖の合成を触媒するに際して合成DNA鎖がより長く伸長するようにPfuDNA合成酵素のアミノ酸配列を人為的に改変したことを特徴とするDNA合成酵素を提供する。この発明によって、高分子DNAをPCR等によって増幅する場合であっても、その全長を効率よく合成、増幅することのできる新規な耐熱性DNA合成酵素が提供される。これによって、DNA鎖の試験管内での合成や増幅、塩基配列の決定等を簡便かつ高精度で行なうことが可能となる。
用途利用分野 微生物酵素剤、DNA合成酵素、DNA合成酵素をコードするDNA配列、耐熱性DNA合成酵素
出願特許   特許 国際特許分類(IPC)
( 1 ) 国立研究開発法人科学技術振興機構, セレスター・レキシコ・サイエンシズ株式会社, . 土居 洋文, 金井 昭夫, 石野 良純, . DNA合成酵素. 特開平11-155578. 1999-06-15
  • C12N  15/09     
  • C12N   9/12     

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