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Specification :イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の品種鑑定法

Country 日本国特許庁(JP)
Gazette 特許公報(B2)
Patent Number 特許第5749466号 (P5749466)
Publication number 特開2012-055253 (P2012-055253A)
Date of registration 平成27年5月22日(2015.5.22)
Date of issue 平成27年7月15日(2015.7.15)
Date of publication of application 平成24年3月22日(2012.3.22)
Title of the invention, or title of the device イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の品種鑑定法
IPC (International Patent Classification) C12Q   1/68        (2006.01)
C12N  15/09        (2006.01)
FI (File Index) C12Q 1/68 A
C12N 15/00 A
Number of claims or invention 3
Total pages 42
Application Number 特願2010-202983 (P2010-202983)
Date of filing 平成22年9月10日(2010.9.10)
Date of request for substantive examination 平成25年7月24日(2013.7.24)
Patentee, or owner of utility model right 【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Inventor, or creator of device 【氏名】岸根 雅宏
Representative 【識別番号】100089118、【弁理士】、【氏名又は名称】酒井 宏明
Examiner 【審査官】北村 悠美子
Document or reference 特開2004-065251(JP,A)
特開2007-037468(JP,A)
特開2003-319782(JP,A)
nature,2005年,Vol.436,p.793-800
DNA research,2002年,Vol.9,p.199-207
Field of search C12Q 1/68
C12N 15/00-15/90
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamIII)
GRAMENE
Scope of claims 【請求項1】
被験ゲノムDNAにおける、4塩基反復のSSR領域の遺伝的多型に基づいてイネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の品種を鑑定する、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の品種の鑑定法であって、
RM12927を、朝日、こがねもち、又は山田錦の鑑定に使用すること、
RM14137を、ヒヨクモチ、又は五百万石の鑑定に使用すること、
RM16604を、ヒヨクモチ、又はわたぼうしの鑑定に使用すること、
RM17039を、朝日の鑑定に使用すること、
RM18204を、彩のかがやきの鑑定に使用すること、
RM22194を、こいしぶきの鑑定に使用すること、
RM23036を、はくちょうもち、又は美山錦の鑑定に使用すること、
RM24481を、ヒヨクモチの鑑定に使用すること、
RM25036を、まっしぐら、又はハナエチゼンの鑑定に使用すること、
RM26957を、秋の詩、又はヒメノモチの鑑定に使用すること、および/または
RM28174を、ななつぼし、又はあきまさりの鑑定に使用すること、
を特徴とする、鑑定法
【請求項2】
以下からなる群より選ばれるプライマーの組合せである、イネにおける4塩基反復のSSR領域を増幅するためのプライマー対を用いる、請求項1記載の鑑定法:
a)配列番号3に示される塩基配列における1~454番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号3に示される塩基配列における547~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
3b)配列番号3に示される塩基配列における1~454番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号3に示される塩基配列における547~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
4a)配列番号4に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号4に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
4b)配列番号4に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号4に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ
a)配列番号7に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号7に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
7b)配列番号7に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号7に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
8a)配列番号8に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号8に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
8b)配列番号8に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号8に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
9a)配列番号9に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号9に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
9b)配列番号9に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号9に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ
5a)配列番号15に示される塩基配列における1~473番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号15に示される塩基配列における527~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
15b)配列番号15に示される塩基配列における1~473番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号15に示される塩基配列における527~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
16a)配列番号16に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号16に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
16b)配列番号16に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号16に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ
8a)配列番号18に示される塩基配列における1~454番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号18に示される塩基配列における547~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
18b)配列番号18に示される塩基配列における1~454番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号18に示される塩基配列における547~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
19a)配列番号19に示される塩基配列における1~464番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号19に示される塩基配列における537~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
19b)配列番号19に示される塩基配列における1~464番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号19に示される塩基配列における537~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ
2a)配列番号22に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号22に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
22b)配列番号22に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号22に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ
4a)配列番号24に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号24に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
24b)配列番号24に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号24に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ
であり、
ここで、前記少なくとも一部の塩基配列が、15個以上のヌクレオチド残基からなり、
前記その均等な塩基配列が、15個以上のヌクレオチド残基からなり、かつイネの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する
【請求項3】
以下からなる群より選ばれるプライマーの組合せを2以上含み、かつ当該2以上の組合せのうちの少なくとも1つが請求項2記載のプライマーの組合せを含むプライマー対のセットを用いる、請求項2記載の鑑定法:
1)下記の1a)および1b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
1a)配列番号1に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
1b)配列番号1に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
2)下記の2a)および2b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
2a)配列番号2に示される塩基配列における1~474番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における527~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
2b)配列番号2に示される塩基配列における1~474番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における527~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
3)請求項記載の3a)および3b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
4)請求項記載の4a)および4b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
5)下記の5a)および5b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
5a)配列番号5に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号5に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
5b)配列番号5に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号5に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
6)下記の6a)および6b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
6a)配列番号6に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号6に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
6b)配列番号6に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号6に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
7)請求項記載の7a)および7b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
8)請求項記載の8a)および8b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
9)請求項記載の9a)および9b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
10)下記の10a)および10b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
10a)配列番号10に示される塩基配列における1~455番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号10に示される塩基配列における545~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
10b)配列番号10に示される塩基配列における1~455番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号10に示される塩基配列における545~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
11)下記の11a)および11b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
11a)配列番号11に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号11に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
11b)配列番号11に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号11に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
12)下記の12a)および12b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
12a)配列番号12に示される塩基配列における1~471番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号12に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
12b)配列番号12に示される塩基配列における1~471番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号12に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
13)下記の13a)および13b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
13a)配列番号13に示される塩基配列における1~459番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号13に示される塩基配列における541~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
13b)配列番号13に示される塩基配列における1~459番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号13に示される塩基配列における541~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
14)下記の14a)および14b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
14a)配列番号14に示される塩基配列における1~464番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号14に示される塩基配列における537~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
14b)配列番号14に示される塩基配列における1~464番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号14に示される塩基配列における537~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
15)請求項記載の15a)および15b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
16)請求項記載の16a)および16b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
17)下記の17a)および17b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
17a)配列番号17に示される塩基配列における1~460番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号17に示される塩基配列における541~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
17b)配列番号17に示される塩基配列における1~460番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号17に示される塩基配列における541~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
18)請求項記載の18a)および18b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
19)請求項記載の19a)および19b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
20)下記の20a)および20b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
20a)配列番号20に示される塩基配列における1~482番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号20に示される塩基配列における519~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
20b)配列番号20に示される塩基配列における1~482番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号20に示される塩基配列における519~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
21)下記の21a)および21b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
21a)配列番号21に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号21に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
21b)配列番号21に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号21に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
22)請求項記載の22a)および22b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
23)下記の23a)および23b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
23a)配列番号23に示される塩基配列における1~474番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号23に示される塩基配列における527~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
23b)配列番号23に示される塩基配列における1~474番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号23に示される塩基配列における527~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
24)請求項記載の24a)および24b)のいずれか1つのプライマーの組合せ
であり、
ここで、前記少なくとも一部の塩基配列が、15個以上のヌクレオチド残基からなり、
前記その均等な塩基配列が、15個以上のヌクレオチド残基からなり、かつイネの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する
Detailed description of the invention 【技術分野】
【0001】
本発明は、イネまたはそれに由来する組織(例、米)、あるいはそれらの加工品の品種鑑定法などに関する。
【背景技術】
【0002】
JAS法に基づき、玄米および精米には、「品種」の表示が義務づけられている。しかしながら、高値で取引されるコシヒカリを中心とした良食味品種では偽装表示が後を絶たず、偽装表示を明らかとするための分析法として、また抑止力として、品種固有のDNAを用いた品種識別技術の開発が進められてきた。その結果、主要品種の識別が可能となり、また抑止力としても一定の効果を発揮しているが、従来技術はあくまでイネの品種「識別」法であり、証拠能力を担保した鑑定法とするためには、ヒトのDNA鑑定レベルへの精度向上が必要である。
【0003】
これまでに開発された米の品種識別法は、利用する技術背景によってRAPD-STS法(特許文献1、2)、SNP法(特許文献3、4)、SSR(Simple Sequence Repeats)法(特許文献5~7)の3つに大きく分けられる。RAPD-STS法は、ランダムプライマーによる分析を元に開発された手法で、DNA増幅の有無を検出する。SNP法は、ゲノム中の一塩基置換を検出する。SSR法は、ゲノム中の2~4塩基単位の反復配列の反復数(配列長)を検出する。
【先行技術文献】
【0004】

【特許文献1】特開2001-095589
【特許文献2】特開2005-073655
【特許文献3】特開2004-248635
【特許文献4】特開2009-219498
【特許文献5】特開平10-057073
【特許文献6】特開2004-065251
【特許文献7】特開2007-037468
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、RAPD-STS法およびSNP法では、基本的に1マーカーによる分析によって2種類の多型しか得られず(情報量が少なく)、近縁種が多い稲ではその識別に多数のマーカーによる分析を必要とする。
【0006】
一方、SSR法では、1マーカーの分析により数種~十数種の多型が得られる(情報量が多い)ため、効率的な識別が可能である。しかしながら、従来開発されたSSR法では、主に2塩基反復のSSRを利用しているため、PCRの特性上検出されるスタッター産物により判定が困難となる場合があった。なお、ヒトのDNA鑑定においては、スタッター産物が少ない4塩基反復のSSRしか用いられていない。
【0007】
したがって、本発明の目的は、イネにおいて、識別性の高い4塩基反復のSSR領域を利用した品種鑑定法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、鋭意検討した結果、イネにおいて、識別性の高い4塩基反復のSSR領域を同定することに成功した。また、かかるSSR領域を同定することにより、当該SSR領域を検出するためのイネのDNAマーカー及びそのマーカーを利用した品種鑑定法を開発することに成功し、本願発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち、本発明は、4塩基反復のSSR領域の遺伝的多型に基づいてイネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の品種を鑑定する、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の品種の鑑定法、ならびにイネにおける4塩基反復のSSR領域を増幅するためのプライマー対、およびプライマーの組合せを2以上含む、プライマー対のセットを提供する。
【発明の効果】
【0010】
SSR法は、従来のRAPD-STS法およびSNP法に比べ情報量が多いため、より効率的に、かつより広範な品種の識別が可能である。また、従来の2塩基反復ではなく4塩基反復のSSRを用いることで、ヒトのDNA鑑定と同一の高い精度が得られる(図1)。したがって、本発明の鑑定法は、イネまたはそれに由来する組織(例、米)、あるいはそれらの加工品の鑑定能力に優れている。また、本発明の鑑定法では、効率的な品種鑑定のために、イネの品種間で遺伝的多型性に富む4塩基反復のSSR領域のみを使用してもよく、特異的な品種鑑定のために、イネの特定の品種に特異的な(稀な)遺伝的多型性を示す(すなわち、特定の品種についての識別性の高い)4塩基反復のSSR領域のみを使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】図1は、2塩基反復(2-bp repeat)と4塩基反復(4-bp repeat)のSSR領域の遺伝子型の分析例を示す図である。2塩基反復では、本来のピークの前後に複数のピークが検出され、複数品種が混在した場合などにピークの識別が困難となる場合がある。4塩基反復では、ほぼ単一のピークとなるため、識別性が高い。
【図2】図2は、本発明による、8つのSSR領域(RM10000、RM11499、RM12927、RM14137、RM15043、RM15764、RM16604、RM17039)の遺伝子型の分析例を示す図である。それぞれのピークの数値を検出し、それを基準となる品種と比較することで品種の特定が行われる。日本晴:左から順に(1)RM17039;(2)RM14137;(3)RM15043;(4)RM10000;(5)RM16604;、(6)RM15764;(7)RM12927;(8)RM11499。コシヒカリ:左から順に(1’)RM17039;(2’)RM14137;(3’)RM15043;(4’)RM10000;(5’)RM16604;、(6’)RM15764;(7’)RM12927;(8’)RM11499。ひとめぼれ:左から順に(1’’)RM17039;(2’’)RM14137;(3’’)RM15043;(4’’)RM10000;(5’’)RM15764;、(6’’)RM16604;(7’’)RM12927;(8’’)RM11499。なお、コシヒカリ、ひとめぼれの(1’)および(2’)のピーク、(1’’)および(2’’)のピークは見かけ上重なっているが、異なる蛍光色を発する蛍光物質による標識を利用することで、実際には識別可能である。
【図3】図3は、RM10000のSSR領域周辺(第1染色体:21845~22844)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「tatc」×15)を示す。下線を付記した部分は、実施例で用いられたプライマーの位置を示す(図4~26も同様)。なお、染色体上の位置は、MSU Rice Genome Annotation Release 6.1(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)に従っている(図4~26も同様)。
【図4】図4は、RM11499のSSR領域周辺(第1染色体:27752831~27753830)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「atag」×13)を示す。
【図5】図5は、RM12927のSSR領域周辺(第2染色体:9609399~9610398)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「atac」×23)を示す。
【図6】図6は、RM14137のSSR領域周辺(第2染色体:34293476~34294475)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「atag」×15)を示す。
【図7】図7は、RM15043のSSR領域周辺(第3染色体:14698350~14699349)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「tcta」×14)を示す。
【図8】図8は、RM15764のSSR領域周辺(第3染色体:28382145~28383144)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「atag」×12)を示す。
【図9】図9は、RM16604のSSR領域周辺(第4染色体:11461847~11462846)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「atag」×14)を示す。
【図10】図10は、RM17039のSSR領域周辺(第4染色体:21798477~21799476)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「atac」×12)を示す。
【図11】図11は、RM18204のSSR領域周辺(第5染色体:9479123~9480122)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「atac」×15)を示す。
【図12】図12は、RM18950のSSR領域周辺(第5染色体:24953090~24954089)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「ttat」×22)を示す。
【図13】図13は、RM19232のSSR領域周辺(第6染色体:215880~216879)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「atac」×12)を示す。
【図14】図14は、RM20092のSSR領域周辺(第6染色体:17296152~17297151)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「agat」×14)を示す。
【図15】図15は、RM21367のSSR領域周辺(第7染色体:10275871~10276870)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「atgt」×20)を示す。
【図16】図16は、RM21859のSSR領域周辺(第7染色体:23228185~23229184)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「tatc」×18)を示す。
【図17】図17は、RM22194のSSR領域周辺(第8染色体:94372~95371)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「cata」×13)を示す。
【図18】図18は、RM23036のSSR領域周辺(第8染色体:18760442~18761441)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「agat」×15)を示す。
【図19】図19は、RM23778のSSR領域周辺(第9染色体:3965696~3966695)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「ataa」×20)を示す。
【図20】図20は、RM24481のSSR領域周辺(第9染色体:17263432~17264431)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「atct」×23)を示す。
【図21】図21は、RM25036のSSR領域周辺(第10染色体:3804619~3805618)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「tatg」×18)を示す。
【図22】図22は、RM25416のSSR領域周辺(第10染色体:14572963~14573962)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「atct」×9)を示す。
【図23】図23は、RM26245のSSR領域周辺(第11染色体:5590572~5591571)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「atct」×12)を示す。
【図24】図24は、RM26957のSSR領域周辺(第11染色体:21235614~21236613)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「atag」×14)を示す。
【図25】図25は、RM27695のSSR領域周辺(第12染色体:4828388~4829387)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「tgta」×13)を示す。
【図26】図26は、RM28174のSSR領域周辺(第12染色体:17657607~17658606)の塩基配列を示す図である。ボックス部分は、SSR領域(日本晴:「tatg」×15)を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品(以下、必要に応じて、「イネ等」と省略する)の品種の鑑定法を提供する。

【0013】
一実施形態では、本発明は、イネの品種の鑑定法に関する。本発明において、「イネ」とは、成長した植物体および未熟な植物体(例、苗)のみならず、枯れた植物体である稲わらをも意味するものとする。イネの品種としては、例えば、コシヒカリ、ひとめぼれ、あきたこまち、ヒノヒカリ、はえぬき、ななつぼし、きらら397、つがるロマン、まっしぐら、キヌヒカリ、こしいぶき、あさひの夢、ほしのゆめ、夢つくし、ハナエチゼン、ちば28号(ふさこがね)、ふさおとめ、ササニシキ、めんこいな、あいちのかおりSBL(あいちのかおり)、日本晴、アケボノ、夢しずく、彩のかがやき、ゆめみづほ、ミルキークイーン、てんたかく、おぼろづき、ふっくりんこ、森のくまさん、まなむすめ、ハツシモ岐阜SL(ハツシモ)、きぬむすめ、ゆめぴりか、チヨニシキ、秋の詩、あきまさり、なすひかり、朝日、ヒヨクモチ、ヒメノモチ、こがねもち、はくちょうもち、わたぼうし、風の子もち、山田錦、五百万石、美山錦が挙げられる。なお、これらの品種の他にも、4塩基反復のSSR領域を用いることにより、鑑定可能なイネの品種が数多く存在し得る。

【0014】
別の実施形態では、本発明は、イネに由来する組織の品種の鑑定法に関する。本発明において、「イネに由来する組織」とは、イネの植物体の一部を意味するものとし、例えば、茎、葉、根部、米(即ち、イネ種子)が挙げられる。米は、玄米または精米のいずれであってもよい。米としてはまた、うるち米、もち米、醸造用米が挙げられる。うるち米、もち米、醸造用米の品種は、表6の記載より明らかである。

【0015】
さらに別の実施形態では、本発明は、イネまたはそれに由来する組織の加工品の品種の鑑定法に関する。本発明において、イネまたはそれに由来する組織の「加工品」とは、イネまたはそれに由来する組織(例、米)を含む物であって、本発明により使用され得るイネDNAを抽出できるものである限り特に限定されない。このような加工品としては、例えば、米の加工品(例、炊飯米、加工米飯、みそ、米菓、米穀粉、包装もち、ビーフン、玄米茶、米粉パン、米粉麺、日本酒、ビール)、稲わらの加工品(例、飼料、敷料、床敷、民芸品)が挙げられる。

【0016】
イネは、第1~12染色体を有する。したがって、イネ等の品種鑑定では、4塩基反復のSSR領域として、これらの染色体上に存在するものが用いられる。また、同一染色体上に存在する4塩基反復のSSR領域を品種鑑定に用いる場合には、より少ない数のSSR領域を測定対象としつつ、遺伝的連鎖の影響を回避することにより品種鑑定の精度を向上させるため、染色体上の位置が離れているSSR領域が用いられる。具体的には、このような4塩基反復のSSR領域は、RM(rice microsatellite)番号により特定できる。例えば、このような4塩基反復のSSR領域としては、第1染色体上に存在するRM10000およびRM11499、第2染色体上に存在するRM12927およびRM14137、第3染色体上に存在するRM15043およびRM15764、第4染色体上に存在するRM16604およびRM17039、第5染色体上に存在するRM18204およびRM18950、第6染色体上に存在するRM19232およびRM20092、第7染色体上に存在するRM21367およびRM21859、第8染色体上に存在するRM22194およびRM23036、第9染色体上に存在するRM23778およびRM24481、第10染色体上に存在するRM25036およびRM25416、第11染色体上に存在するRM26245およびRM26957、第12染色体上に存在するRM27695およびRM28174が挙げられる。以下の表1~3において、主要48品種の遺伝子型について、4塩基反復のSSR領域の遺伝的多型を示す。なお、表1~3中のデータは、実施例1、2および表12~14に基づき作成されたものであり、品種間における4塩基反復のSSR領域の遺伝的多型は、これまでに報告されていない。

【0017】
【表1】
JP0005749466B2_000002t.gif

【0018】
【表2】
JP0005749466B2_000003t.gif

【0019】
【表3】
JP0005749466B2_000004t.gif

【0020】
品種鑑定に用いられる4塩基反復のSSR領域の数は、1以上であれば特に限定されないが、例えば、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、21以上、22以上、23以上、または24以上であってもよい。

【0021】
具体的には、イネ等の品種の鑑定法は、PCR法等の遺伝子増幅法を用いて行うことができる。本発明はまた、このような用途に使用できる、イネにおける4塩基反復のSSR領域を増幅するためのプライマー対を提供する。4塩基反復のSSR領域としては、例えば、上述したRM番号により特定されるものが挙げられる。以下、各RM番号で特定される4塩基反復のSSR領域、および本領域を増幅するためのプライマー対について、詳述する。

【0022】
1)RM10000
RM10000のSSR領域(例、日本晴では「tatc」×15)は、配列番号1に示される塩基配列(RM10000のSSR領域周辺の塩基配列)において、471~530番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図1)。したがって、RM10000のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号1に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号1に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図1を参照)。

【0023】
2)RM11499
RM11499のSSR領域(例、日本晴では「atag」×13)は、配列番号2に示される塩基配列(RM11499のSSR領域周辺の塩基配列)において、475~526番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図2)。したがって、RM11499のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号2に示される塩基配列における1~474番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における527~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号2に示される塩基配列における1~474番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における527~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図2を参照)。

【0024】
3)RM12927
RM12927のSSR領域(例、日本晴では「atac」×23)は、配列番号3に示される塩基配列(RM12927のSSR領域周辺の塩基配列)において、455~546番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図3)。したがって、RM12927のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号3に示される塩基配列における1~454番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号3に示される塩基配列における547~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号3に示される塩基配列における1~454番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号3に示される塩基配列における547~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図3を参照)。

【0025】
4)RM14137
RM14137のSSR領域(例、日本晴では「atag」×15)は、配列番号4に示される塩基配列(RM14137のSSR領域周辺の塩基配列)において、471~530番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図4)。したがって、RM14137のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号4に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号4に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号4に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号4に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図4を参照)。

【0026】
5)RM15043
RM15043のSSR領域(例、日本晴では「tcta」×14)は、配列番号5に示される塩基配列(RM15043のSSR領域周辺の塩基配列)において、473~528番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図5)。したがって、RM15043のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号5に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号5に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号5に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号5に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図5を参照)。

【0027】
6)RM15764
RM15764のSSR領域(例、日本晴では「atag」×12)は、配列番号6に示される塩基配列(RM15764のSSR領域周辺の塩基配列)において、477~524番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図6)。したがって、RM15764のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号6に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号6に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号6に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号6に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図6を参照)。

【0028】
7)RM16604
RM16604のSSR領域(例、日本晴では「atag」×14)は、配列番号7に示される塩基配列(RM16604のSSR領域周辺の塩基配列)において、473~528番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図7)。したがって、RM16604のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号7に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号7に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号7に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号7に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図7を参照)。

【0029】
8)RM17039
RM17039のSSR領域(例、日本晴では「atac」×12)は、配列番号8に示される塩基配列(RM17039のSSR領域周辺の塩基配列)において、477~524番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図8)。したがって、RM17039のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号8に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号8に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号8に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号8に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図8を参照)。

【0030】
9)RM18204
RM18204のSSR領域(例、日本晴では「atac」×15)は、配列番号9に示される塩基配列(RM18204のSSR領域周辺の塩基配列)において、471~530番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図9)。したがって、RM18204のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号9に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号9に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号9に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号9に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図9を参照)。

【0031】
10)RM18950
RM18950のSSR領域(例、日本晴では「ttat」×22)は、配列番号10に示される塩基配列(RM18950のSSR領域周辺の塩基配列)において、457~544番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図10)。したがって、RM18950のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号10に示される塩基配列における1~455番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号10に示される塩基配列における545~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号10に示される塩基配列における1~455番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号10に示される塩基配列における545~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図10を参照)。

【0032】
11)RM19232
RM19232のSSR領域(例、日本晴では「atac」×12)は、配列番号11に示される塩基配列(RM19232のSSR領域周辺の塩基配列)において、477~524番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図11)。したがって、RM19232のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号11に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号11に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号11に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号11に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図11を参照)。

【0033】
12)RM20092
RM20092のSSR領域(例、日本晴では「agat」×14)は、配列番号12に示される塩基配列(RM20092のSSR領域周辺の塩基配列)において、473~528番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図12)。したがって、RM20092のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号12に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号12に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号12に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号12に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図12を参照)。

【0034】
13)RM21367
RM21367のSSR領域(例、日本晴では「atgt」×20)は、配列番号13に示される塩基配列(RM21367のSSR領域周辺の塩基配列)において、461~540番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図13)。したがって、RM21367のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号13に示される塩基配列における1~460番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号13に示される塩基配列における541~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号13に示される塩基配列における1~460番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号13に示される塩基配列における541~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図13を参照)。

【0035】
14)RM21859
RM21859のSSR領域(例、日本晴では「tatc」×18)は、配列番号14に示される塩基配列(RM21859のSSR領域周辺の塩基配列)において、465~536番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図14)。したがって、RM21859のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号14に示される塩基配列における1~464番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号14に示される塩基配列における537~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号14に示される塩基配列における1~464番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号14に示される塩基配列における537~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図14を参照)。

【0036】
15)RM22194
RM22194のSSR領域(例、日本晴では「cata」×13)は、配列番号15に示される塩基配列(RM22194のSSR領域周辺の塩基配列)において、475~526番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図15)。したがって、RM22194のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号15に示される塩基配列における1~474番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号15に示される塩基配列における527~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号15に示される塩基配列における1~474番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号15に示される塩基配列における527~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図15を参照)。

【0037】
16)RM23036
RM23036のSSR領域(例、日本晴では「agat」×15)は、配列番号16に示される塩基配列(RM23036のSSR領域周辺の塩基配列)において、471~530番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図16)。したがって、RM23036のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号16に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号16に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号16に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号16に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図16を参照)。

【0038】
17)RM23778
RM23778のSSR領域(例、日本晴では「ataa」×20)は、配列番号17に示される塩基配列(RM23778のSSR領域周辺の塩基配列)において、461~540番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図17)。したがって、RM23778のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号17に示される塩基配列における1~460番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号17に示される塩基配列における541~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号17に示される塩基配列における1~460番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号17に示される塩基配列における541~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図17を参照)。

【0039】
18)RM24481
RM24481のSSR領域(例、日本晴では「atct」×23)は、配列番号18に示される塩基配列(RM24481のSSR領域周辺の塩基配列)において、455~546番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図18)。したがって、RM24481のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号18に示される塩基配列における1~454番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号18に示される塩基配列における547~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号18に示される塩基配列における1~454番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号18に示される塩基配列における547~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図18を参照)。

【0040】
19)RM25036
RM25036のSSR領域(例、日本晴では「tatg」×18)は、配列番号19に示される塩基配列(RM25036のSSR領域周辺の塩基配列)において、465~536番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図19)。したがって、RM25036のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号19に示される塩基配列における1~464番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号19に示される塩基配列における537~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号19に示される塩基配列における1~464番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号19に示される塩基配列における537~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図19を参照)。

【0041】
20)RM25416
RM25416のSSR領域(例、日本晴では「atct」×9)は、配列番号20に示される塩基配列(RM25416のSSR領域周辺の塩基配列)において、483~518番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図20)。したがって、RM25416のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号20に示される塩基配列における1~482番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号20に示される塩基配列における519~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号20に示される塩基配列における1~482番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号20に示される塩基配列における519~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図20を参照)。

【0042】
21)RM26245
RM26245のSSR領域(例、日本晴では「atct」×12)は、配列番号21に示される塩基配列(RM26245のSSR領域周辺の塩基配列)において、477~524番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図21)。したがって、RM26245のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号21に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号21に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号21に示される塩基配列における1~476番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号21に示される塩基配列における525~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図21を参照)。

【0043】
22)RM26957
RM26957のSSR領域(例、日本晴では「atag」×14)は、配列番号22に示される塩基配列(RM26957のSSR領域周辺の塩基配列)において、473~528番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図22)。したがって、RM26957のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号22に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号22に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号22に示される塩基配列における1~472番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号22に示される塩基配列における529~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図22を参照)。

【0044】
23)RM27695
RM27695のSSR領域(例、日本晴では「tgta」×13)は、配列番号23に示される塩基配列(RM27695のSSR領域周辺の塩基配列)において、475~526番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図23)。したがって、RM27695のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号23に示される塩基配列における1~474番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号23に示される塩基配列における527~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号23に示される塩基配列における1~474番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号23に示される塩基配列における527~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図23を参照)。

【0045】
24)RM28174
RM28174のSSR領域(例、日本晴では「tatg」×15)は、配列番号24に示される塩基配列(RM28174のSSR領域周辺の塩基配列)において、471~530番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図24)。したがって、RM28174のSSR領域を増幅するためのプライマー対として、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せを用いることができる。このようなプライマー対としては、例えば、a)配列番号24に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号24に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ、ならびにb)配列番号24に示される塩基配列における1~470番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号24に示される塩基配列における531~1000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せが挙げられる(例、図24を参照)。

【0046】
上述した「均等な塩基配列」は、イネの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列であり得る。したがって、所定の塩基配列(例、配列番号Xに示される塩基配列においてY~Z番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列)に均等な塩基配列は、所定の塩基配列において数個(より好ましくは1、2または3個)の塩基の修飾(置換、欠失、挿入または付加)を含む塩基配列であり得る。このような均等な塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかであり、イネの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、あるいはイネの品種において上記RM番号で特定されるSSR領域周辺の塩基配列を解読することにより、決定できる。

【0047】
プライマーを構成するヌクレオチド残基(標的部位にアニーリングする相補部分のヌクレオチド残基)の数は、プライマーが標的部位にアニーリングして、4塩基反復のSSR領域を含む目的産物を特異的に増幅できる限り特に限定されず、例えば、15個以上、16個以上、17個以上、18個以上、または20個以上であってもよい。また、プライマーを構成するヌクレオチド残基の数は、例えば、50個以下、40個以下、または30個以下であってもよい。

【0048】
プライマーは、増幅産物の検出のため、蛍光物質で標識されていてもよい。このような蛍光物質としては、例えば、6-FAM、VIC、NED、PETが挙げられる。プライマーはまた、標的部位にアニーリングする相補部分に加えて、他の部分を含んでいてもよい。このような他の部分としては、例えば、増幅産物の末端にA残基を付加するための部分(例、gtttctt)が挙げられる。A残基を付加するためのこのような部分がない場合、増幅産物の末端にA残基が付加したもの、および付加しなかったものの混合物が、増幅産物として得られる場合がある。このような場合、シークエンサー等の検出器において検出されるピークが二又になることがあり、好ましくない。したがって、1つのシャープなピークを検出するためには、上記のような部分を用いることが好ましい。

【0049】
増幅産物のサイズは、測定機器において、4塩基反復のSSR領域の遺伝的多型に基づく増幅長の差異を検出できるようなサイズである限り特に限定されない。例えば、増幅産物のサイズの決定にシークエンサーが用いられる場合、1塩基長の長さの差異でさえも検出し得るため、4塩基反復のSSR領域の遺伝的多型に基づく増幅長の差異を高感度に検出できる。増幅産物の下限サイズは、使用される測定機器において、増幅産物のサイズが検出できるかぎり特に限定されないが、例えば、50bp以上、100bp以上、150bp以上、200bp以上であってもよい。増幅産物の上限サイズは、使用される測定機器において、増幅産物のサイズが検出できるかぎり特に限定されないが、例えば、500bp以下、450bp以下、400bp以下、350bp以下、または300bp以下であってもよい。したがって、プライマー対は、このような長さの増幅産物が増幅されるように、このような長さで離れている2つの領域に対して設計され得る。

【0050】
上述したように、イネ等の品種の鑑定法は、PCR法等の遺伝子増幅法を用いて行うことができるが、本発明はまた、このような用途に使用できる、2以上のプライマー対を含む、プライマー対のセットを提供する。本発明の知見なしに、上述したプライマー対を2以上組み合せる動機付けは、従来存在しない。本発明のセットに含まれる2以上のプライマー対は、異なる蛍光色を発する別々の蛍光物質により標識されたものであってもよい。このような別々の蛍光物質により標識された2以上のプライマー対を用いて4塩基反復のSSR領域を多重的に増幅することにより、異なる蛍光色を発する2以上の増幅産物が得られ、これを、シークエンサーの1レーンに供することにより、複数の4塩基反復のSSR領域の遺伝的多型性を効率的に解析できる(例、図2を参照)。本発明のセットに含まれるプライマー対の数は2以上であれば特に限定されないが、上限数は、蛍光色のバリエーションに応じて調製してもよい。したがって、本発明のセットに含まれるプライマー対の数は、例えば、2個、3個、または4個であってもよい。

【0051】
本発明のセットは、例えば、以下からなる群より選ばれるプライマーの組合せを2以上(例、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上)含んでいてもよい:
1)上記1a)および1b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
2)上記2a)および2b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
3)上記3a)および3b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
4)上記4a)および4b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
5)上記5a)および5b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
6)上記6a)および6b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
7)上記7a)および7b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
8)上記8a)および8b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
9)上記9a)および9b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
10)上記10a)および10b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
11)上記11a)および11b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
12)上記12a)および12b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
13)上記13a)および13b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
14)上記14a)および14b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
15)上記15a)および15b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
16)上記16a)および16b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
17)上記17a)および17b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
18)上記18a)および18b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
19)上記19a)および19b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
20)上記20a)および20b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
21)上記21a)および21b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
22)上記22a)および22b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
23)上記23a)および23b)のいずれか1つのプライマーの組合せ;
24)上記24a)および24b)のいずれか1つのプライマーの組合せ。

【0052】
より具体的には、本発明の鑑定法は、被験ゲノムDNAにおける、4塩基反復のSSR領域の遺伝的多型に基づいてイネ等の品種を鑑定することによって達成される。被験ゲノムDNAは、イネ等(例、米)から自体公知の方法によって調製できる。具体的には、イネ等(例、米)の品種の鑑定は、a)イネに由来する組織(例、米)あるいはイネまたはイネに由来する組織の加工品からゲノムDNAを抽出し、b)PCR法等の遺伝子増幅法により、4塩基反復のSSR領域を含む部分を増幅し、c)4塩基反復のSSR領域の増幅長を決定し(例、4塩基反復のSSR領域(24種)の遺伝子型を同定し)、次いで、決定された4塩基反復のSSR領域の増幅長の情報を、各品種についての4塩基反復のSSR領域の増幅長の情報と照合すること(例、同定された遺伝子型の情報を、各品種の遺伝子型の情報と照合すること)により、行われる。具体的には、照合は、4塩基反復のSSR領域の増幅長の情報を開示するデータ(例、表1~5、表12~14)を用いて行われてもよい。照合はまた、標品を併用することにより、被験物および標品との間において、4塩基反復のSSR領域を含む部分が増幅された増幅産物の検出ピークの概要を比較することにより行なわれてもよい。標品は、任意のイネの品種であり特に限定されないが、例えば、基準品種である日本晴、ならびに被験物と同じ品種であることが疑われる特定の品種が挙げられる。本発明の鑑定法は、例えば、米の品種の決定、混入米の有無の決定などに有用である。

【0053】
本発明の鑑定法では、上述したRM番号で特定される4塩基反復のSSR領域を用いることができるが、目的に応じて、特定のRM番号で特定される4塩基反復のSSR領域を用いてもよい。

【0054】
例えば、イネの品種間で遺伝的多型性に富むSSR領域が、効率的な品種鑑定に資するため、好適に使用され得る。SSR領域の遺伝的多型性は、例えば、以下の表4より明らかである。したがって、本発明では、例えば、少なくとも5種以上の遺伝的多型が認められるSSR領域(RM12927、RM14137、RM15764、RM16604、RM23036、RM24481、RM25036、RM26957、RM28174)、少なくとも6種以上の遺伝的多型が認められるSSR領域(RM12927、RM25036、RM26957)、少なくとも8種の遺伝的多型が認められるSSR領域(RM12927)が、品種鑑定において好適に使用されてもよい。

【0055】
【表4】
JP0005749466B2_000005t.gif

【0056】
また、イネの特定の品種に特異性の高い(稀な)遺伝的多型を示す(すなわち、特定の品種についての識別性の高い)SSR領域が、特異的な品種鑑定に資するため、好適に使用され得る。特定の品種に特異性の高いSSR領域の遺伝的多型は、例えば、以下の表5より明らかである。したがって、本発明では、例えば、下記特定の品種の検査が求められている場合(例、下記特定の品種の同定が要求されている場合、および下記特定の品種の米の混入が疑われている場合)において、下記特定の品種に特異性な遺伝的多型を示す下記特定のRM番号により特定されるSSR領域が、品種鑑定において好適に使用されてもよい。

【0057】
【表5】
JP0005749466B2_000006t.gif

【0058】
以下に、本発明を詳細に説明するが、本実施例により本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【0059】
実施例1:米飯(粒状)からの品種識別のプロトコル
〔一般事項〕
品種の育成地もしくは最大生産地から入手した原種の分析結果を基準とし(表6)、被検査物の分析結果を照合することにより、品種を判別する。
【実施例】
【0060】
【表6】
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【実施例】
【0061】
〔測定の原理〕
ゲノムDNA上に存在する単純反復配列(SSR:Simple Sequence Repeat)を含む領域を特異的に増幅するプライマーを用い、PCR法でDNA断片を増幅し、その長さの違いを利用して品種識別を行う。
【実施例】
【0062】
〔方法の要旨〕
米飯1粒から、抽出キット(GM quicker 2)を用いてDNAを抽出する。そのDNAを鋳型に、片方を蛍光標識したプライマーペアを用いて、SSRを含むDNA領域をPCR増幅する。得られた蛍光標識DNA断片は、Genetic Analyzerを用いて泳動し、フラグメント長を検出する。24のプライマーセットから得られるDNA断片すべてについて、このフラグメント解析を行い、それらを基準品種と比較することで品種の特定を行う。
【実施例】
【0063】
〔検査試料〕
米飯1粒を試料とする。
【実施例】
【0064】
〔購入試薬〕
- イソプロピルアルコール(99.5%,特級)
- GM quicker 2(ニッポン・ジーン,Cat.No.310-065091)
- Gotaq Colorless Master Mix(プロメガ,Cat.No.M7132(5mL),M7133(25mL))
- HiDiホルムアミド(Applied Biosystems,Cat.No.4311320)
- GeneScan 500LIZ Size Standard(Applied Biosystems,Cat.No.4352759)
- Genetic Analyzer Buffer with EDTA(Applied Biosystems,Cat.No.402824)
- POP-4 ポリマー(Applied Biosystems,使用するGenetic Analyzerに応じる)
- プライマー(表7)
【実施例】
【0065】
【表7】
JP0005749466B2_000008t.gif
【実施例】
【0066】
〔調製試薬〕
-プライマーMix
蛍光標識プライマー(フォワードプライマー)、非標識プライマー(リバースプライマー)(いずれも100μM原液)を等量混合し、その混合液を滅菌水にて50倍希釈する(終濃度1μM each)。-20℃で冷凍保存する。
【実施例】
【0067】
〔機器・プログラム〕
- 微量遠心機(13,000xg以上の遠心力が得られ、1.5mLのチューブが遠心可能なもの)
- ボルテックスミキサー
- 恒温水槽またはヒートブロック(1.5 mLチューブを60℃に加温可能なもの)
- サーマルサイクラー(4.6.6に示す反応プログラムが実行可能なもの。開発元において、GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)、iCycler(Bio-Rad)、Thermal Cycler Dice(タカラバイオ)の3機種では確認済)
- Genetic Analyzer(Applied Biosystems)
- GeneMapperソフトウェア(Applied Biosystems)
【実施例】
【0068】
〔実験操作〕
A)操作準備作業
操作者は、白衣、眼鏡、手袋を着用する。
【実施例】
【0069】
B)操作場所
DNA抽出からPCR増幅反応液調製まで、供試サンプル以外のDNAが混入しないクリーンな環境で操作する。
【実施例】
【0070】
C)試薬及び器具
- 滅菌蒸留水
- イソプロピルアルコール(99.5%,特級)
- GM quicker 2(ニッポン・ジーン,Cat.No.310-065091)
- Gotaq Colorless Master Mix(プロメガ,Cat.No. M7132(5mL),M7133(25mL))
- HiDiホルムアミド(Applied Biosystems,Cat.No. 4311320)
- GeneScan 500LIZ Size Standard(Applied Biosystems,Cat.No.4352759)
- Genetic Analyzer Buffer with EDTA(Applied Biosystems,Cat.No.402824)
- プライマーMix(4.4参照)
- 1.5 mLマイクロチューブ(オートクレーブして使用)
- 96well PCRプレート及びプレートシール(またはキャップ)
- ピペットチップ(オートクレーブして使用)
- マイクロピペット
- ホモジナイゼーション用ペッスル(ディスポーザブル)
- 微量遠心機(13,000xg以上の遠心力が得られ、1.5mLのチューブが遠心可能なもの)
- ボルテックスミキサー
- 恒温水槽またはヒートブロック(1.5mLチューブを60℃に加温可能なもの)
- サーマルサイクラー
- Genetic Analyzer(Applied Biosystems)
【実施例】
【0071】
D)試験材料の取り出し
米飯1粒を試料とする。損傷を受けた粒や、他の粒が付着したものは使用しない。包装米飯等で、容器壁面に水滴が付着している場合には、その水滴に触れないように採取する。
【実施例】
【0072】
E)DNAの抽出操作
本工程は、GM quicker 2(ニッポン・ジーン)を使用する。イソプロパノール以外の試薬及びSpin Columnは、キット内容物を使用する。
(1)米飯1粒を1.5mLマイクロチューブに取り、250μLのGE1 Bufferを加える。
(2)ホモジナイゼーション用ペッスルを用いて、固形物がなくなりペースト状になるまで米飯を破砕する。
(3)破砕液に、10μLのProteinase K、2μLのα-Amylase及び5μLのRNase Aを添加する。ボルテックスミキサーにて30秒間攪拌する。
(4)恒温水槽またはヒートブロックにて15分間、60℃で加温する。途中5分おきに、ボルテックスミキサーにて攪拌する。
(5)40μLのGE2-K Bufferを添加し、ボルテックスミキサーにてよく混和する。
(6)13,000xg以上、5分間、室温で遠心する。
(7)沈殿や浮遊物を可能な限りとらないようにして、上清280μLを新しい1.5mLチューブに回収する。
(8)105μLのGB3 Buffer、105μLのイソプロパノールを添加した後、10~12回チューブを激しく転倒させ、よく混和する。析出物が生じ白濁した場合には、液が透明になるまで十分混和する。
(9)(8)の混合液全量をSpin Columnに移し、13,000xg以上、30秒間、室温で遠心する。濾液は廃棄する。
(10)650μLのGW BufferをSpin Columnに加え、13,000xg以上、1分間、室温で遠心する。濾液は廃棄する。
(11)Spin Columnを新しい1.5 mLチューブに移し、50μLのTE (pH8.0)を滴下する。
(12)3分間、室温で静置した後、13,000xg以上、1分間、室温で遠心する。得られた溶出液をDNA溶液とする。DNA溶液は、短期の場合は4℃、長期の場合は、-20℃で保存する。
【実施例】
【0073】
F)PCR増幅操作
本工程は、PCR用の酵素、バッファー、dNTPがあらかじめ混合されたGotaq Colorless Master Mix(プロメガ)を用いる。反応液調製は、基本的に氷上もしくは、それに準拠した環境で行う。
【実施例】
【0074】
(1)DNA溶液ごとに25反応分(24プライマー+1)のプレミックスを調製する。
【実施例】
【0075】
【表8】
JP0005749466B2_000009t.gif
【実施例】
【0076】
(2)PCRプレートの24wellに、24種類のプライマーmix(1μM each、4.4参照)を2.5μLずつ加える。
(3)(1)のプレミックスをボルテックスミキサーにて良く混合し、スピンダウンした後、7.5μLずつ(2)の24wellに分注する。
(4)プレートをシールもしくはキャップで閉じ、溶液をスピンダウンした後、以下のプログラムにより増幅反応を行う。なお、反応条件はすべてのPrimerで共通である。
【実施例】
【0077】
【表9】
JP0005749466B2_000010t.gif
【実施例】
【0078】
G)DNAマーカーの検出
(1)泳動を効率的に行うため、24種のPCR産物a~gの6本に混合(Pooling)する(表3参照。なお、それぞれのセットは4種の蛍光標識を1つずつ含む)。また、PCR産物の濃度を調製するため、Poolingの際には混合比率の調製も同時に行う。表3には、開発元にて採用しているPCR産物ごとの希釈倍率(20~160倍)を目安として記載したが、使用機器により変動するため、希釈倍率は適宜変更する。なお、表3には160μLの希釈サンプルの調製例も記載したが、必ずしもこれに従う必要はなく、効率的な方法で希釈と混合を行う。
【実施例】
【0079】
【表10】
JP0005749466B2_000011t.gif
【実施例】
【0080】
(2)以下の通り、96wellプレート内で泳動サンプルを調製する。なお、Size StandardとHiDiホルムアミドについてはあらかじめ、サンプル数+1分の混合液を作製し、それを9μLずつ希釈PCR溶液1μLに加えてもよい。
【実施例】
【0081】
【表11】
JP0005749466B2_000012t.gif
【実施例】
【0082】
(3)サーマルサイクラーを用いて、95℃、5分間加熱し、直ちに氷上で5分静置する。
(4)使用するGenetic Analyzerの機種のフラグメント解析のプロトコルに従い、POP-4ポリマー、Genetic Analyzer Buffer with EDTA、キャピラリーを用いて解析を行う。
(5)GeneMapperソフトウェアを用いて、結果の解析を行う。
【実施例】
【0083】
実施例2:米の品種の遺伝子型の同定
実施例1に記載されたプロトコルにしたがって、各品種について、遺伝的多型性が認められた、4塩基反復のSSR領域(24種)の遺伝子型を同定した。結果を表12~14に示す。表12~14では、遺伝子型は、「日本晴」を基準〔=A(bp)〕とし、その値から何bp離れているかで表示した。また、本発明による、8つのSSR領域の遺伝子型の分析例を図2に示す。なお、24種のマーカーはいずれも、4塩基反復のSSR領域を用いて作製されているため、一部を除いて基本的に4の倍数塩基離れた値が検出された。
【実施例】
【0084】
【表12】
JP0005749466B2_000013t.gif
【実施例】
【0085】
【表13】
JP0005749466B2_000014t.gif
【実施例】
【0086】
【表14】
JP0005749466B2_000015t.gif
【実施例】
【0087】
実施例3:米の品種の鑑定
実施例1中の〔実験操作〕の項目A)~G)にしたがってアッセイする。次いで、得られた遺伝子型の情報を、表1~3および/または表4、5、あるいは表12~14中の情報と照合することによって、米の品種を鑑定する。なお、表中の空欄の部分は、品種内で遺伝的多型が認められる可能性があるため、判定には用いない。
【実施例】
【0088】
参考例1:うるち米の品種間における特定のSSR領域の遺伝的多型の評価
他の4塩基反復のSSR領域(18種:RM11489、RM12281、RM12333、RM14272、RM16282、RM17331、RM17822、RM18102、RM20183、RM21172、RM21802、RM22195、RM24461、RM25283、RM25733、RM26012、RM27824、RM28504)について、イネの品種間における遺伝的多型を評価した。評価したイネの品種は、うるち米の16品種(日本晴、コシヒカリ、ひとめぼれ、あきたこまち、ヒノヒカリ、はえぬき、ななつぼし、きらら397、つがるロマン、まっしぐら、キヌヒカリ、こしいぶき、あさひの夢、ほしのゆめ、夢つくし、あいちのかおり)であった。
その結果、上記SSR領域(18種)は、上記16品種間で遺伝的多型を示さなかった。
Drawing
【図3】
0
【図4】
1
【図5】
2
【図6】
3
【図7】
4
【図8】
5
【図9】
6
【図10】
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【図11】
8
【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
14
【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22】
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【図23】
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【図24】
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【図25】
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【図26】
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【図1】
24
【図2】
25