【0031】 〔EcFumaraseのクローニング:PCRによるfumC遺伝子の増幅〕 次に、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)登録番号JW1603に記載の目的遺伝子(fumC)の塩基配列情報に基づきプライマーをデザインし、PCRを用いてfumC DNA断片の増幅を行った。
【0034】 〔BsMDHのクローニング:PCRによるmdh遺伝子の増幅〕 次に、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)登録番号BSU29120に記載の目的遺伝子(mdh)の塩基配列情報に基づきプライマーをデザインし、PCRを用いてmdh DNA断片の増幅を行った。
【0049】 ここで、Kcat / Km 値は見かけの二次反応速度定数であり、遊離の酸素と基質との間の反応性を示すため、酸素の触媒効率を表す指標となる。図7に示したように、PaeAspDHおよびReuAspDHは、37℃で、AfAspDHより、それぞれ約25倍、約60倍高い還元的アミノ化活性を示している。また、NH3のKm値も減少していることから、PaeAspDH、ReuAspDHともに常温にて工業的な利用が可能であることが確認できる。なお、想定上BjaAspDHは、PaeAspDHおよびReuAspDHと同程度の良好な発現が見られたが、アスパラギン酸脱水素酵素活性がないことも再度確認した。図1に示した検索結果では、想定上BjaAspDHはAfAspDHとアミノ酸配列の相同性はかなり高いが、この事実は、単に相同性が高いだけでは、酵素活性は予見できないことを意味している。