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Specification :(In Japanese)非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法、及びその利用

Country (In Japanese)日本国特許庁(JP)
Gazette (In Japanese)特許公報(B2)
Patent Number P5858543
Date of registration Dec 25, 2015
Date of issue Feb 10, 2016
Title of the invention, or title of the device (In Japanese)非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法、及びその利用
IPC (International Patent Classification) C12N  15/09        (2006.01)
C12N   1/21        (2006.01)
C12P  21/02        (2006.01)
C12N   9/10        (2006.01)
FI (File Index) C12N 15/00 ZNAA
C12N 1/21
C12P 21/02 C
C12N 9/10
Number of claims or invention 19
Total pages 55
Application Number P2012-520488
Date of filing Jun 16, 2011
Exceptions to lack of novelty of invention (In Japanese)特許法第30条第1項適用 研究集会名 生物化学専攻平成22年度博士論文発表会 主催者名 国立大学法人東京大学 開催日 平成23年1月14日
International application number PCT/JP2011/063778
International publication number WO2011/158895
Date of international publication Dec 22, 2011
Application number of the priority 2011047663
2010137635
Priority date Mar 4, 2011
Jun 16, 2010
Claim of priority (country) (In Japanese)日本国(JP)
日本国(JP)
Date of request for substantive examination Jun 13, 2014
Patentee, or owner of utility model right (In Japanese)【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
Inventor, or creator of device (In Japanese)【氏名】横山 茂之
【氏名】向井 崇人
【氏名】坂本 健作
【氏名】松元 明子
Representative (In Japanese)【識別番号】110000338、【氏名又は名称】特許業務法人HARAKENZO WORLD PATENT & TRADEMARK
Examiner (In Japanese)【審査官】川合 理恵
Document or reference (In Japanese)特表2005-502322(JP,A)
特表2010-510798(JP,A)
KATO, Jun-ichi and KATAYAMA, Tsutomu.,Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli.,EMBO J.,2001年,Vol. 20, No. 15,p. 4253-4262,Materials and methods
KATO, Jun-ichi and HASHIMOTO, Masayuki.,Construction of consecutive deletions of the Escherichia coli chromosome.,Mol. Syst. Biol.,2007年,Vol. 3, No. 132,p. 1-7,第3頁右欄第9行-第5頁左欄第14行
MUKAI, Takahito et al.,Codon reassignment in the Escherichia coli genetic code.,Nucleic Acids Res.,Nucleic Acids Res.,2010年 8月11日,Vol. 38, No. 22,p. 8188-8195
Field of search C12N 15/09
C12N 1/21
C12N 9/10
C12P 21/02
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamIII)
CAplus/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS(STN)
Scope of claims (In Japanese)【請求項1】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
(1)UAGコドンを認識するtRNAを細菌内に発現させるステップと、
(2)前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を細菌内に発現させるステップと、
(3)UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を細菌に対して行うステップと、
(4)細菌内の前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、
を含み、
前記(1)~(4)のステップにおける前記各細菌は全て同一の細菌であり、
前記細菌は、大腸菌または枯草菌であり、
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolA、並びに枯草菌のaccD、acpS、cspR、dapB、divIC、dnaA、fmt、folD、ftsA、map、mrpD、murE、murG、plsX、ppnK、racE、resB、resC、rnpA、rplX、rpmGB、rpmH、rpsG、secA、secY、topA、trmD、yacM、ydiC、yloQ、ypuH及びysxCの中から選択される1以上の遺伝子であり、
前記処理が、前記1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物を前記細菌に導入する処理及び/又は前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理であ
前記DNA構築物は、前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換えた前記1以上の遺伝子の改変型遺伝子を含み、
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換える改変である、作製方法。
【請求項2】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
UAGコドンを認識するtRNAを発現する細菌に対して、
(5)前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を発現させるステップと、
(6)UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を行うステップと、
(7)前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、を含み、
前記細菌は、大腸菌または枯草菌であり、
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolA、並びに枯草菌のaccD、acpS、cspR、dapB、divIC、dnaA、fmt、folD、ftsA、map、mrpD、murE、murG、plsX、ppnK、racE、resB、resC、rnpA、rplX、rpmGB、rpmH、rpsG、secA、secY、topA、trmD、yacM、ydiC、yloQ、ypuH及びysxCの中から選択される1以上の遺伝子であり、
前記処理が、前記1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物を前記細菌に導入する処理及び/又は前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理であ
前記DNA構築物は、前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換えた前記1以上の遺伝子の改変型遺伝子を含み、
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換える改変である、作製方法。
【請求項3】
前記細菌が、UAGコドンを認識するtRNAであって前記アミノアシル-tRNA合成酵素によってはアシル化されないtRNAを発現しており、
当該tRNAをコードする遺伝子を欠損させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の作製方法。
【請求項4】
前記非天然タンパク質が非天然型アミノ酸あるいはα-ヒドロキシ酸を含む非天然タンパク質であることを特徴とする請求項1又は2に記載の作製方法。
【請求項5】
前記細菌が大腸菌であることを特徴とする請求項1~4の何れか1項に記載の作製方法。
【請求項6】
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolAの中から選択される任意の6つの遺伝子であることを特徴とする請求項1~5の何れか1項に記載の作製方法。
【請求項7】
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、hda、mreC及びhemAの遺伝子であることを特徴とする請求項6に記載の作製方法。
【請求項8】
前記1以上の遺伝子として、遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が低下する遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項6または7に記載の作製方法。
【請求項9】
遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が低下する上記遺伝子が、大腸菌のsucB遺伝子であることを特徴とする請求項8に記載の作製方法。
【請求項10】
前記細菌が大腸菌であり、
前記DNA構築物は、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolAの中から選択される1以上の遺伝子の機能を発現するDNA構築物であることを特徴とする請求項1~5の何れか1項に記載の作製方法。
【請求項11】
前記DNA構築物は、さらに大腸菌のsucB遺伝子の機能を発現するDNA構築物であることを特徴とする請求項10に記載の作製方法。
【請求項12】
前記DNA構築物は、細菌染色体にトランス及び/又はシスに補充されるバクテリア人工染色体、プラスミドあるいは直鎖状DNAであることを特徴とする請求項1~11のいずれか1項に記載の作製方法。
【請求項13】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌を作製するためのDNA構築物であって、
UAGコドンを認識するtRNA及び前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素の存在下において、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現し、
前記組換え細菌は、大腸菌由来または枯草菌由来であり、
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolA、並びに枯草菌のaccD、acpS、cspR、dapB、divIC、dnaA、fmt、folD、ftsA、map、mrpD、murE、murG、plsX、ppnK、racE、resB、resC、rnpA、rplX、rpmGB、rpmH、rpsG、secA、secY、topA、trmD、yacM、ydiC、yloQ、ypuH及びysxCの中から選択される1以上の遺伝子であり、
前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換えた前記1以上の遺伝子の改変型遺伝子を含むことを特徴とするDNA構築物。
【請求項14】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌であって、
UAGコドンを認識するtRNAを発現すること
前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を発現すること
UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物が導入されていること、及び/又は細菌染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていることと、
前記翻訳終結因子をコードする遺伝子が欠損していることと、
前記組換え細菌は、大腸菌由来または枯草菌由来であり、
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolA、並びに枯草菌のaccD、acpS、cspR、dapB、divIC、dnaA、fmt、folD、ftsA、map、mrpD、murE、murG、plsX、ppnK、racE、resB、resC、rnpA、rplX、rpmGB、rpmH、rpsG、secA、secY、topA、trmD、yacM、ydiC、yloQ、ypuH及びysxCの中から選択される1以上の遺伝子であること、
前記DNA構築物は、前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換えた前記1以上の遺伝子の改変型遺伝子を含むことと、
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換える改変であることと、
を特徴とする組換え細菌。
【請求項15】
前記組換え細菌が大腸菌由来であることを特徴とする請求項14に記載の組換え細菌。
【請求項16】
組換え細菌を用いる非天然タンパク質の製造方法であって、
(a)非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸を活性化しうるアミノアシル-tRNA合成酵素と、
(b)前記アミノアシル-tRNA合成酵素の存在下において非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸と結合可能な、UAGコドンを認識するtRNAと、
(c)ランダムに、あるいは所望の位置に1つ以上のナンセンス変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、
を請求項14に記載の組換え細菌又は当該組換え細菌の抽出液内で発現させることを特徴とする非天然タンパク質の製造方法。
【請求項17】
前記組換え細菌が大腸菌由来であることを特徴とする請求項16に記載の非天然タンパク質の製造方法。
【請求項18】
非天然タンパク質の製造に用いる組換え細菌の抽出物であって、
前記組換え細菌が、
大腸菌由来または枯草菌由来であることと、
UAGコドンを認識するtRNAを発現すること
前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を発現すること
UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物が導入されていること、及び/又は細菌染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていること
前記翻訳終結因子をコードする遺伝子が欠損していること
前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolA、並びに枯草菌のaccD、acpS、cspR、dapB、divIC、dnaA、fmt、folD、ftsA、map、mrpD、murE、murG、plsX、ppnK、racE、resB、resC、rnpA、rplX、rpmGB、rpmH、rpsG、secA、secY、topA、trmD、yacM、ydiC、yloQ、ypuH及びysxCの中から選択される1以上の遺伝子であることと、
前記DNA構築物は、前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換えた前記1以上の遺伝子の改変型遺伝子を含むことと、
前記改変は、前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換える改変であることと、
を特徴とする抽出物。
【請求項19】
前記組換え細菌が大腸菌由来であることを特徴とする請求項18に記載の抽出物。
Detailed description of the invention (In Japanese)【技術分野】
【0001】
本発明は、非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法、非天然タンパク質製造用の組換え細菌を作製するためのDNA構築物、非天然タンパク質製造用の組換え細菌、組換え細菌を用いる非天然タンパク質の製造方法、非天然タンパク質の製造に用いる組換え細菌の抽出物に関する。特に、本発明は、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損した組換え細菌の作製方法、該遺伝子を欠損させるためのDNA構築物、該遺伝子が欠損した組換え細菌、該遺伝子が欠損した組換え細菌を用いる非天然タンパク質の製造方法、該遺伝子が欠損した組換え細菌の抽出物に関する。
【背景技術】
【0002】
非天然タンパク質(又は超タンパク質)と呼ばれる、所望の位置のアミノ酸残基を非天然型アミノ酸及び/又はα—ヒドロキシ酸で置換したタンパク質がある。この非天然タンパク質は、天然タンパク質に存在しない新しい生理活性、触媒活性、構造及び機能を有する。そのため、非天然タンパク質の合成は、従来のタンパク質工学における制約を乗り越える必要不可欠な基盤技術となる。
【0003】
近年では、大腸菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳類細胞を用いて非天然タンパク質を合成することが可能である。このような合成システムにおいて、非天然型アミノ酸が非特異的な位置に導入されることは望ましくないため、一般的には、ストップコドンの一つであるアンバーコドン(UAGコドン)に非天然型アミノ酸が導入される。
【0004】
アンバーコドンへの非天然型アミノ酸の導入は、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子と競合することが知られており、非特許文献1、2では、大腸菌の翻訳終結因子であるRF-1の活性を弱めることによって、非天然型アミノ酸の導入効率が改善されること、非特許文献3では、無細胞タンパク質合成系においてRF-1の量を減らすことによって、アンバーコドンへ効率よく非天然型アミノ酸が導入されることが報告されている。
【0005】
さらに、RF-1をコードするprfA遺伝子を欠損させることで非天然型アミノ酸の導入効率をさらに改善できると考えられる。ここで、prfA遺伝子を欠損させる方法として、非特許文献4では、ゲノム上の全ての遺伝子のアンバーコドンをオーカーコドン又はオパールコドンに置き換える方法が開示されている。また、非特許文献5、6では、アンバーコドンを全てオーカーコドンに置き換え、prfA遺伝子を欠損させた大腸菌が報告されている。
【先行技術文献】
【0006】

【特許文献1】米国特許出願公開第2009/0317910号明細書
【0007】

【非特許文献1】Ryden,S.M., and Isaksson,L.A., Molecular and General Genetics,193,38-45 (1984)
【非特許文献2】Kleina,L.G., et al., Journal of Molecular Biology, 213, 705-717 (1990)
【非特許文献3】Short III,G.F., et al., Biochemistry, 38, 8808-8819 (1999)
【非特許文献4】Forster,A.C. et al., Genome Research,17,1-6 (2007)
【非特許文献5】Wang,H.H., et al., Nature,460, 894-898 (2009)
【非特許文献6】“Synthetic Biology Projects”、[online]、[平成21年4月30日検索]、インターネット<URL:http://arep.med.harvard.edu/SBP/>
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
ところで、種々の細菌の翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損株に対するニーズがあるが、上記の従来技術には、欠損株の作製に手間がかかるという課題がある。例えば、特許文献5、6に開示の大腸菌は、非天然型アミノ酸導入タンパク質に用いる大腸菌としての汎用性が低く、この大腸菌よりも汎用性が高いprfA欠損株に対するニーズがある。しかしながら、非特許文献4に開示の技術を用いて欠損株を作製する場合には、ゲノム上の全ての遺伝子のアンバーコドン(314個)を置き換えることが必要であり、手間がかかるため、非天然タンパク質を合成する系としては好ましくない。
【0009】
従って、本発明の主な目的は、細菌の翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させる場合に好適に適用し得る、非天然タンパク質製造用の組換え細菌を作製するための新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、以下の好適な実施形態を含む。
【0011】
(形態1)
第一の視点において、本発明は、非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
(1)UAGコドンを認識するtRNAを細菌内に発現させるステップと、
(2)前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を細菌内に発現させるステップと、
(3)UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を細菌に対して行うステップと、
(4)細菌内の前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、
を含み、前記(1)~(4)のステップにおける前記各細菌は全て同一の細菌であり、前記処理が、前記1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物を前記細菌に導入する処理及び/又は前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理であることを特徴とする。
【0012】
(形態2)
第一の視点における別の作製方法として、本発明は、非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
UAGコドンを認識するtRNAを発現する細菌に対して、
(5)前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を発現させるステップと、
(6)UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を行うステップと、
(7)前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、を含み、
前記処理が、前記1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物を前記細菌に導入する処理及び/又は前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理であることを特徴とする。
【0013】
(形態15)
第二の視点において、本発明は、非天然タンパク質製造用の組換え細菌を作製するためのDNA構築物であって、UAGコドンを認識するtRNA及び前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素の存在下において、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する全ての遺伝子から選択される1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現することを特徴とするDNA構築物を含むことを特徴とする。
【0014】
(形態16)
第三の視点において、本発明は、非天然タンパク質製造用の組換え細菌であって、UAGコドンを認識するtRNAを発現すること、前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を発現すること、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物が導入されていること、及び/又は細菌染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていること、及び、前記翻訳終結因子をコードする遺伝子が欠損していること、を特徴とする。
【0015】
(形態18)
第四の視点において、本発明は、組換え細菌を用いる非天然タンパク質の製造方法であって、(a)非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸を活性化しうるアミノアシルtRNA合成酵素と、(b)前記アミノアシルtRNA合成酵素の存在下において非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸と結合可能な、UAGコドンを認識するtRNAと、(c)ランダムに、あるいは所望の位置に1つ以上のナンセンス変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、を形態16の組換え細菌又は当該組換え細菌の抽出液内で発現させることを特徴とする。
【0016】
(形態20)
第五の視点において、本発明は、非天然タンパク質の製造に用いる組換え細菌の抽出物であって、前記組換え細菌が、UAGコドンを認識するtRNAを発現すること、前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を発現すること、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物が導入されていること、及び/又は細菌染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていること、前記翻訳終結因子をコードする遺伝子が欠損していることを特徴とする。
【発明の効果】
【0017】
本発明によれば、細菌の翻訳終結因子をコードする遺伝子欠損させる場合においても、非天然タンパク質製造用の組換え細菌を容易に作製することができる。そのため、所望の細菌又は大腸菌を用いた非天然タンパク質の製造効率を容易に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】図1は、prfA欠損体におけるアンバーコドンの翻訳を示す図である。
【図2】図2は、BAC7を導入したprfA欠損体の生育能力を示す図である。
【図3】図3は、BAC7上の遺伝子配座を示す図である。
【図4】図4は、prfA遺伝子の欠損を示す図である。
【図5】図5は、アンバーコドンへのグルタミン酸の導入を示す図である。
【図6】図6は、非天然タンパク質製造用の大腸菌の増殖速度を示す図である。
【図7】図7は、アンバーコドンへの非天然型アミノ酸の導入を示す図である。
【図8】図8は、グルタミン酸又はチロシンが導入されたタンパク質の質量分析結果を示す図である。
【図9】図9は、アンバーコドンへのアジドフェニルアラニンの導入を示す図である。
【図10】図10は、BAC6を導入した大腸菌のprfA遺伝子の欠損を示す図である。
【図11】図11は、BAC3を導入した大腸菌のprfA遺伝子の欠損を示す図である。
【図12】図12は、HMS174(DE3)のprfA遺伝子の欠損を示す図である。
【図13】図13は、BAC8上の遺伝子配座を示す図である。
【図14】図14は、prfA遺伝子の欠損を示す図である。
【図15】図15は、UAGトリプレットを4-アジドフェニルアラニン又はO-スルホチロシンへ再定義した非天然タンパク質製造用の大腸菌の増殖を示す図である。
【図16】図16は、Nap3発現系が導入された非天然タンパク質製造用の大腸菌の増殖を示す図である。
【図17】図17は、HST08由来のRFzero-iy株における、sucB遺伝子及びiodoTyrRS-mj(D286R)/Nap3過剰発現系の大腸菌の増殖速度を示す図である。
【図18】図18は、BW25113由来のRFzero-iy株における、sucB遺伝子及びiodoTyrRS-mj(D286R)/Nap3過剰発現系の大腸菌の増殖速度を示す図である。
【図19】図19は、BW25113由来のRFzero-iy株における、アンバーコドンへの3-ヨード-L-チロシンの導入を示す図である。
【図20】図20は、BW25113由来のRFzero-iy株における、アンバーコドンへの3-ヨード-L-チロシンの導入を示す図である。
【図21】図21は、supE tRNA分子の改変を説明する図であり、(a)は、改変前のsupE tRNA分子の二次構造を示しており、四角で囲った塩基がランダム化する部分であり。(b)は、改変supE tRNA分子を作製する3種のオリゴマーのアニーリング状態を示す模式図であり、(c)は、ランダム化部位に出現した各塩基の頻度を表している。
【図22】図22は、改変supE tRNA分子を導入した大腸菌における、アンバーコドンへのグルタミンの導入を示す図である。
【図23】図23は、改変supE tRNA分子を導入した大腸菌の増殖を示す図であり、(a)~(c)は異なる条件下での増殖を示している。
【図24】図24は、BW25113、HMS174(DE3)およびBL21(DE3)由来のRFzero-iy株における増殖速度を示す図である。
【図25】図25は、BW25113、HMS174(DE3)およびBL21(DE3)由来のRFzero-iy株における、対応する非天然型アミノ酸の有無による増殖を示す図である。
【図26】図26は、数種の非天然型アミノ酸の構造を示す図である。
【図27】図27は、UAGコドンを3-ヨード-L-チロシン以外の非天然型アミノ酸に再定義したBW25113RFzero-iy株における増殖速度を示す図である。
【図28】図28は、UAGコドンを3-ヨード-L-チロシン以外の非天然型アミノ酸に再定義したBW25113RFzero-iy株における、対応する非天然型アミノ酸の有無による増殖を示す図である。
【図29】図29は、BW25113RFzero-iy株、およびUAGコドンを3-ヨード-L-チロシン以外の非天然型アミノ酸に再定義した株における、アンバーコドンへの3-ヨード-L-チロシンまたは他の非天然型アミノ酸の導入を示す図である。
【図30】図30は、3-ヨード-L-チロシンが導入されたことを確認する質量分析の結果を示す図である。
【図31】図31は、prfA株におけるアンバーコドンへの非天然型アミノ酸の導入効率を示す図である。
【図32】図32は、H4ヒストンにアセチルリジンが導入されたことを確認する質量分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
[非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製]
本発明に係る組換え細菌の作製方法は、非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
(1)UAGコドンを認識するtRNAを細菌内に発現させるステップと、
(2)前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を細菌内に発現させるステップと、
(3)UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を細菌に対して行うステップと、
(4)細菌内の前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、
を含み、
前記(1)~(4)のステップにおける前記各細菌は全て同一の細菌であり、
前記処理が、前記1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物を前記細菌に導入する処理及び/又は前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理である、構成、又は、
非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法であって、
UAGコドンを認識するtRNAを発現する細菌に対して、
(5)前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を発現させるステップと、
(6)UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理を行うステップと、
(7)前記翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させるステップと、を含み、
前記処理が、前記1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物を前記細菌に導入する処理及び/又は前記細菌の染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変を導入する処理である、構成であればよい。

【0020】
なお、上記(3)及び(6)のステップにおいて、さらに、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失し、これにより細菌の増殖速度が低下することが知られている遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための処理が含まれていてもよい。

【0021】
なお、本発明に係る非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法において、(1)UAGコドンを認識するtRNAを細菌内に発現させるステップと、(2)前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を細菌内に発現させるステップとを含む場合に、当該細菌は、UAGコドンを認識する別のtRNAをもともと発現している細菌であってもよい。例えば、詳しくは後述するが、UAGコドンを認識する大腸菌由来のtRNAを発現する大腸菌に対して、UAGコドンを認識する古細菌のtRNAと、この古細菌のtRNAを非天然型アミノ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素とを発現させるようにしてもよい。

【0022】
また、上記(1)~(4)又は上記(5)~(7)のステップの処理を施される細菌が、UAGコドンを認識するtRNAであって上記(2)又は上記(5)のステップにおいて導入されるアミノアシル-tRNA合成酵素によってはアシル化されないtRNAを発現している細菌である場合には、そのtRNAをコードする遺伝子を欠損させることが好ましい。例えば、詳しくは後述するが、内在性のアンバーサプレッサーtRNAを発現している大腸菌に対して、古細菌のtRNAを発現させ、かつ古細菌のtRNAをアシル化する古細菌のアミノアシル-tRNA合成酵素(大腸菌のtRNAをアシル化することができない)を導入する場合には、大腸菌が保持する内在性のアンバーサプレッサーtRNAをコードする遺伝子を欠損させることが好ましい。本遺伝子を欠損させることによって、UAGコドンにおいて、目的とする非天然型アミノ酸等によってアシル化されているtRNAとの競合を回避でき、非天然型アミノ酸等を効率良くタンパク質に導入することができる。本遺伝子を欠損させるステップは、上記(1)~(4)又は上記(5)~(7)のステップとの関係において、どの段階で実施されてもよい。

【0023】
UAGコドンを認識する内在性のtRNAを発現している細菌に対して、このtRNAを非天然型アミノ酸等によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を導入する場合に、当該細菌が、このtRNAを天然型アミノ酸によってアシル化する内在性のアミノアシル-tRNA合成酵素が発現している細菌であるときには、天然型アミノ酸を結合させる当該アミノアシル-tRNA合成酵素をコードする遺伝子を欠損させることが好ましい。本遺伝子を欠損させることによって、UAGコドンにおいて、目的とする非天然型アミノ酸等によってアシル化されているtRNAとの競合を回避でき、非天然型アミノ酸等を効率良くタンパク質に導入することができる。

【0024】
上記(1)~(4)の各ステップの順序に特に制限はなく、例えば(1)のステップと(2)のステップとが同時に行なわれてもよい。しかしながら、翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損効率の観点から、上記(4)のステップよりも前に、上記(1)及び上記(2)のステップを行うことが好ましい。また、上記(1)及び(2)のステップが完了した後に、(3)のステップ及び(4)のステップをこの順で行うことが特に好ましい。

【0025】
同様に、上記(5)~(7)の各ステップの順序に特に制限はないが、翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損効率の観点から、上記(7)のステップよりも前に、上記(5)のステップを行うことが好ましい。また、上記(5)、(6)及び(7)のステップをこの順で行うことが特に好ましい。

【0026】
本明細書では、UAGコドンを認識するtRNAのことを「アンバーサプレッサーtRNA」ともいう。このtRNAは、非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化され得るものである。

【0027】
本明細書において「非天然タンパク質」とは、天然型アミノ酸のみから生成されるタンパク質以外のタンパク質を意味している。非天然タンパク質としては、例えば、非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸を含む非天然タンパク質が挙げられる。

【0028】
また、「非天然型アミノ酸」とは、生物が普遍的に利用する20種類の標準型アミノ酸以外のアミノ酸を意味する。非天然型アミノ酸としては、非限定的に、例えば、リジン誘導体、及びチロシン誘導体が含まれる。また、本明細書においては、上記標準型アミノ酸が例えばリン酸化等によって修飾されているアミノ酸もまた、非天然型アミノ酸に含まれることを意図している。

【0029】
ここで、リジン誘導体としては、ε位の窒素原子に結合した水素原子が他の原子又は原子団に置換されたものが好ましい。このようなリジン誘導体には、例えば、ピロリジン、Nε-t-ブトキシカルボニルリジン(Boc-リジン)、Nε-アセチルリジン、Nε-t-ベンジルオキシカルボニルリジン(Z-リジン)、及びNε-(o-アジドベンジルオキシカルボニル)リジン(アジドZ-リジン)が含まれる。また、アミノ酸以外にも、α-ヒドロキシ酸を含むアミノ酸すなわち、Boc-リジン主鎖部分のアミノ基をヒドロキシ基に置換したBocLysOHなどが含まれる。

【0030】
チロシン誘導体としては、チロシンのフェニル基の3位又は4位に置換基を有する3位置換チロシン及び4位置換チロシン、及び酸素原子に置換基を有するO-修飾チロシンが含まれる。3位置換チロシンとしては、3-ヨード-L-チロシン、3-ブロモ-L-チロシン、3-クロロ-L-チロシン、3-アジド-L-チロシン及び3-ヒドロキ-L-シチロシンが含まれる。また、4位置換チロシンとしては、4-アセチル-L-フェニルアラニン、4-ベンゾイル-L-フェニルアラニン及び4-アジド-L-フェニルアラニンが含まれる。O-修飾チロシンとしては、O-スルホチロシンが含まれる。以下、本明細書では、3-ヨード-L-チロシン、3-ブロモ-L-チロシン及び3-クロロ-L-チロシンのことを、それぞれ、単に、3-ヨードチロシン、3-ブロモチロシン及び3-クロロチロシンと称する。

【0031】
翻訳終結因子は、終結因子又はポリペプチド鎖終結因子ともいい、mRNA上の終止コドンを認識し、ポリペプチド鎖をリボソームから遊離させる因子である。UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子(以下、単に、「UAGを認識する翻訳終結因子」ともいう)としては、例えば大腸菌及び枯草菌(Bacillus subtilis)等の細菌では、RF-1である。UAGを認識する翻訳終結因子をコードする遺伝子(以下、単に、「UAG認識翻訳終結因子遺伝子」ともいう)としては、配列番号1に示す核酸配列からなる大腸菌のprfA遺伝子等が含まれる。

【0032】
本明細書において「UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損」とは、当該遺伝子が細胞内に存在しないことを指す場合のほか、当該遺伝子のORFの大半が欠損している場合、当該遺伝子の主要部分が欠損している場合、当該遺伝子が発現しない場合、あるいは当該遺伝子に変異が含まれており翻訳終結因子がUAGコドンを認識できないなど翻訳終結因子としての機能が阻害されている場合なども含むことを意図している。

【0033】
UAG認識翻訳終結因子遺伝子は、遺伝子の相同性組換えを利用した方法など、周知の遺伝子破壊方法によって欠損させることができるが、特に、Red/ET Recombination SystemQuick and Easy BAC MODIFICATION Kit(Gene Bridges GmbH、ドイツ)を用いることが好ましい。ここで、アンバーサプレッサーtRNAを発現するように細菌を形質転換した後に、UAG認識翻訳終結因子遺伝子を欠損させることが、欠損効率の点で好ましい。

【0034】
本明細書において「UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する」とは、ある遺伝子の機能に関し、UAG認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を完全に喪失する場合のほか、機能の一部を喪失する場合、機能が阻害される場合、及び機能が低下する場合も含むことを意図している。ある遺伝子が、UAG認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する機構としては、例えば、UAGコドンで翻訳が終結せず、C末端に余分なペプチドが付加されることによって、タンパク質の機能が阻害される機構が考えられる。あるいは、UAGコドンで翻訳が終結せず、染色体上その遺伝子の下流にある遺伝子の翻訳が適切になされなくなり、この下流の遺伝子のタンパク質の機能が阻害される機構が考えられる。しかしながら機能を喪失する機構はこれらに限定されるものではない。

【0035】
本明細書において「UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子」は、終止コドンがUAGコドンである遺伝子であって、UAG認識翻訳終結因子遺伝子の上記定義の欠損によって、機能を喪失する遺伝子、及び、終止コドンがUAGコドンではないが、染色体上、終止コドンがUAGコドンである遺伝子の下流にある遺伝子であって、終止コドンがUAGコドンである上流の遺伝子の翻訳終結が適切になされないことによって、適切に翻訳されなくなる遺伝子を意図している。

【0036】
本明細書において「遺伝子の機能を発現させる」とは、その遺伝子の正常に機能するタンパク質が翻訳されるようにすることを意図している。したがって、「UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させる」とは、UAG認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の正常なタンパク質が、当該翻訳終結因子の非存在下において発現するようにすることを意図している。

【0037】
本発明に用いられる細菌としては、外来遺伝子の導入又は遺伝子の改変が可能な細菌であれば特に制限はない。なお、本発明は、UAGコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、単独で欠損させると致死になる遺伝子を発現させると、prfA遺伝子を欠損させた大腸菌は生育可能になるという、本発明者らが見出した知見に基づいて完成したものである。大腸菌以外においても、UAGコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、単独で欠損させると致死になる遺伝子を発現させると、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させても生育可能になると考えられる。そのため、本発明を適用できる細菌は、大腸菌に限定されず、枯草菌などの他の細菌を含むものである。

【0038】
本明細書において「DNA構築物」とは、細菌に導入できる形態であって、細胞内で自己複製が可能なもの、又は細胞の染色体内に組み込まれ得るものが意図される。DNA構築物としては、バクテリア人工染色体(BAC)、プラスミド及び直鎖状DNAの形態が可能である。

【0039】
形質転換させる細菌として大腸菌のHST08株を用い、DNA構築物としてBACを用いる場合には、BACとしては、miniFレプリコンを有するBACが好ましい。一方、Fプラスミドを保有する大腸菌を形質転換させる細菌として選択する場合には、他のオリジン、例えばColibP9オリジンを有するプラスミドに遺伝子を導入してBACを作製することが好ましい。

【0040】
DNA構築物は、細菌染色体にトランス及び/又はシスに補充(導入)されるものである。本明細書において「細菌染色体にトランスに補充(導入)される」とは、細菌の細胞内には導入されるものの、細菌染色体に組み込まれないことを意図している。また、本明細書において「細菌染色体にシスに補充(導入)される」とは、細菌の細胞内に導入され、さらに細菌染色体に組み込まれることを意図している。

【0041】
UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物とは、具体的には、UAG認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の終止コドンをアンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換えたこれらの改変型遺伝子を含むDNA構築物を指す。終止コドンをアンバーコドン以外のコドンとすることによって、UAGを認識する翻訳終結因子が存在しない場合であっても、本来の位置で翻訳を終止させることができ、これらの遺伝子の正常に機能するタンパク質を生成することができる。したがって、このDNA構築物を細菌内に導入することによって、UAGを認識する翻訳終結因子が存在しない場合であっても、UAG認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を細菌内において発現させることができる。

【0042】
例えば、周知の遺伝子組み換え技術を用いて、細菌から対象となる遺伝子又は当該遺伝子を含むオペロンをクローニングした後、PCRなどを用いて各遺伝子の終止コドンをUAGからUAA又はUGAに置換する変異を導入する。次いで、これら改変した遺伝子又はオペロンをBAC又はプラスミドに導入することにより、所望のDNA構築物を調製できる。あるいはこれらの遺伝子及びオペロンをつなぎ合わせて直鎖状DNAとすることもできる。

【0043】
ほかにも、TaKaRaのPrimeStar GXLなどを用いたオーバーラップPCR法を用いて複数のオペロンをつないでフラグメントを作製し、そのフラグメントをBACプラスミドに導入してもよい。ここで、20kbp未満のフラグメントを作製する場合には、TaKaRaのHST08株を用いることが好ましい。また、20kbp以上のフラグメントを作製する場合には、Red/ET Recombination SystemQuick and Easy BAC MODIFICATION Kit(Gene Bridges GmbH、ドイツ)を用いることが好ましい。

【0044】
DNA構築物を細菌染色体に導入する場合、細菌染色体にトランスに導入してもよいし、細菌染色体にシスに導入してもよい。言い換えると、DNA構築物に組み込まれた遺伝子をDNA構築物から発現させてもよいし、これらの遺伝子を大腸菌染色体にノックインして、発現させてもよい。大腸菌染色体に遺伝子をノックインする方法は、周知の方法を採用することができる。

【0045】
また、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変の導入とは、具体的には、細菌の染色体上にある、UAG認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子に対して、当該遺伝子の終止コドンを、アンバーコドン(UAG)からオーカーコドン(UAA)又はオパールコドン(UGA)に置き換える改変を導入することを指す。細菌の染色体上にあるこれらの遺伝子の終止コドンをアンバーコドン以外のコドンとすることによって、UAGを認識する翻訳終結因子が存在しない場合であっても、本来の位置で翻訳を終止させることができ、これらの遺伝子の正常に機能するタンパク質を生成することができる。したがって、このような改変を細菌の染色体に導入することによって、UAGを認識する翻訳終結因子が存在しない場合であっても、UAG認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を細菌内において発現させることができる。

【0046】
染色体上の遺伝子の終止コドンに改変を導入する方法としては、周知の方法を用いて行うことができ、例えば、遺伝子の相同性組換えを利用する方法、あるいはランダムに細菌染色体上に生じる突然変異の中から該当する変異を選別する方法などが可能である。

【0047】
遺伝子をトランスに導入して発現させる方法、遺伝子をシスに導入して発現させる方法、及び染色体上のアンバーコドンを改変して発現させる方法を組み合わせて採用することもできる。例えば、7つの遺伝子の機能を発現させる場合に、6つの遺伝子をDNA構築物によって細菌の細胞内に導入し、残りの1つの遺伝子について染色体上にある当該遺伝子のアンバーコドンを改変することによって、7つの遺伝子の機能を発現させるようにしてもよい。

【0048】
UAG認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の中には、単独で遺伝子欠損させると致死になる遺伝子も含まれている。そのため、UAG認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によってこれらの遺伝子の機能が喪失することにより、細菌が生育しなくなる場合が考えられる。そのため、UAG認識翻訳終結因子遺伝子の非存在下においてもその機能を発現させる遺伝子、すなわち、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する全ての遺伝子から選択される1以上の遺伝子には、これら単独で遺伝子欠損させると致死になる遺伝子が含まれていることが好ましい。

【0049】
UAGコドンで翻訳終結する、単独で欠損させると致死になる遺伝子としては、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、lpxK、hemA及びlolAが挙げられる。coaD、murF、hda、mreC、lpxK、hemA及びlolAの遺伝子の核酸配列を、それぞれ、配列番号2、3、4、5、6、7及び8に示す。なお、各配列番号によって表されているこれら遺伝子の核酸配列は、大腸菌K-12株のものであり、他の菌株においては塩基の置換が含まれる場合もあるが、それらも上記遺伝子として含まれる。

【0050】
枯草菌における、UAGコドンで翻訳終結する、単独で欠損させると致死になる遺伝子としては、accD、acpS、cspR、dapB、divIC、dnaA、fmt、folD、ftsA、map、mrpD、murE、murG、plsX、ppnK、racE、resB、resC、rnpA、rplX、rpmGB、rpmH、rpsG、secA、secY、topA、trmD、yacM、ydiC、yloQ、ypuH及びysxCの遺伝子が挙げられる。

【0051】
また、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子のうち、終止コドンがUAGコドンではないが、染色体上、終止コドンがUAGコドンである遺伝子の下流にある遺伝子であるmreD及びhemKの遺伝子は、その上流の遺伝子(mreC、hemA)の翻訳が正しく終結しないと、自身の翻訳が影響を受けると考えられる。mreD及びhemKの遺伝子どちらも必須遺伝子である。そのため、これらの遺伝子も、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する全ての遺伝子から選択される1以上の遺伝子に含まれていることが好ましい。

【0052】
大腸菌において、UAG認識翻訳終結因子遺伝子の非存在下においてもその機能を発現させる遺伝子としては、coaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolAの中から選択される1以上の遺伝子であることが好ましく、これらの中から選択される任意の6つの遺伝子であることがより好ましく、これら全ての遺伝子が選択されることが特に好ましい。

【0053】
また、UAG認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の中には、機能の喪失によって細菌が致死になるわけではないが、機能の喪失によって細菌の増殖速度が低下する遺伝子も含まれる。細菌の増殖速度が低下すると、得られるタンパク質の量が低下することが予想される。そのため、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する全ての遺伝子から選択される1以上の遺伝子には、機能の喪失によって細菌の増殖速度が低下することが知られている遺伝子が含まれていることが好ましい。

【0054】
大腸菌において、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失し、これにより細菌の増殖速度が低下することが知られている遺伝子であって、UAG認識翻訳終結因子遺伝子の非存在下においてもその機能を発現させる遺伝子としては、後述する実施例3に挙げられているfliN,fliP,fliQ,sucB,ubiF,ulaF,atpE,fabHが好ましく、中でもsucB遺伝子であることが特に好ましい。

【0055】
[非天然タンパク質の製造方法]
非天然タンパク質の製造は、周知の製造方法を採用することができる。例えば、(a)非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸を活性化しうるアミノアシル-tRNA合成酵素と、(b)当該アミノアシル-tRNA合成酵素の存在下において非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸と結合可能なアンバーサプレッサーtRNAと、(c)ランダムに、あるいは所望の位置にナンセンス変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子とを、所望の細菌、又は所望の細菌の細胞抽出液(抽出物)内で発現させる非天然タンパク質の製造方法を採用することができる。本製造方法において、細菌を培養する培地中、又は細胞抽出液内に、非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸を添加しておくことにより、この非天然型アミノ酸及びα-ヒドロキシ酸をタンパク質に導入することができる。ここで、培地及び細胞抽出液に添加すべき非天然型アミノ酸及びα-ヒドロキシ酸は、前記(a)におけるアミノアシル-tRNA合成酵素に対応するもの、すなわち当該アミノアシル-tRNA合成酵素によって活性化されるものである。

【0056】
具体的には、メタノサルシナ・マゼイあるいはメタノサルシナ・バルケリのピロリジルtRNA合成酵素(PylRS、あるいはpylS遺伝子)とtRNAPyl(pylT遺伝子)とを大腸菌に導入すればピロリジンをタンパク質に導入することができる。また、メタノサルシナ・マゼイのPylRSのH61K,Y384F変異体(BocLysRS1)と、K61R,E131G,Y384F変異体(BocLysRS2)とを導入すれば、Boc-リジン及びBocLysOHを導入することができる。メタノサルシナ・マゼイのPylRSのY384F,Y306A変異体(ZLysRS)を導入すれば、Z-リジン、2-クロロ-Z-リジン、2-ニトロ-Z-リジン及び2-アジド-Z-リジンを導入することができる。メタノサルシナ・マゼイのPylRSのH63Y,S193R,N203T,M300F,A302G,Y384W変異体を導入すれば、BocLysOHを特異的に認識するので、BocLysOHを導入することができる。メタノサルシナ・マゼイのPylRSのN203T,L301I,L305I,Y306F,L309A,C348F変異体(AcLysRS2、未発表)を導入すれば、アセチルリジンを導入することができる。さらに、メタノサルシナ・マゼイのPylRSのA302F、Y306A、N346S、C348I、Y384F変異体を導入すれば、3-(3-ヨードフェニル)乳酸、3-(3-ブロモフェニル)乳酸、3-(4-アセチルフェニル)乳酸、3-(4-ベンゾイルフェニル)乳酸、3-(4-アジドフェニル)乳酸、3-(3-メチル-4-ヒドロキシフェニル)乳酸などの3置換乳酸を導入することができる。
なお、メタノサルシナ・バルケリのPylRS変異体(AcKRS-3,Neumann H et al. A method for genetically installing site-specific acetylation in recombinant histones defines the effects of H3 K56 acetylation. Chin et al., Mol Cell. 2009 Oct 9; 36(1):153-63.)を導入しても、アセチルリジンを導入することができる。このほかにも、Yanagisawaら(Yanagisawa T. et al, Chem. Biol., 15, 1187-1197 (2008))により報告されているメタノサルシナ・マゼイのPylRS変異体を用いて、Nε-アリルオキシカルボニル-L-リジン(AlocLys)およびNε-(o-アジドベンジルオキシカルボニル)-L-リジン(AzZLys)を導入することができる。

【0057】
また、以下のアミノアシル-tRNA合成酵素変異体を大腸菌に導入し、対応する非天然型アミノ酸を培地中に添加することによって、非天然タンパク質を製造することができる。
・非天然型アミノ酸が3-ヨードチロシン及びアジドチロシン:アミノアシル-tRNA合成酵素変異体がiodoTyrRS-mjのH70A,D158T,I159S,D286Y変異体(Sakamoto K, Murayama K, Oki K, Iraha F, Kato-Murayama M, Takahashi M, Ohtake K, Kobayashi T, Kuramitsu S, Shirouzu M, Yokoyama S. Genetic encoding of 3-iodo-L-tyrosine in Escherichia coli for single-wavelength anomalous dispersion phasing in protein crystallography. Structure. 2009 Mar 11;17(3):335-44.)。
・非天然型アミノ酸がヒドロキシチロシン:アミノアシル-tRNA合成酵素変異体がmutDHPRSのY32L,A67S,H70N,A167Q変異体(Guo J, Wang J, Anderson JC, Schultz PG. Addition of an alpha-hydroxy acid to the genetic code of bacteria. Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(4):722-5.)。
・非天然型アミノ酸がアセチルフェニルアラニン:アミノアシル-tRNA合成酵素変異体がLW1のY32L,D158G,I159C,L162R変異体(Wang L, Zhang Z, Brock A, Schultz PG. Addition of the keto functional group to the genetic code of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jan 7;100(1):56-61. Epub 2002 Dec 23.)。
・非天然型アミノ酸がベンゾイルフェニルアラニン:アミノアシル-tRNA合成酵素変異体がMjBpaRS-1のY32G,E107S,D158T,I159S変異体(Chin JW, Martin AB, King DS, Wang L, Schultz PG. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 20;99(17):11020-4. Epub 2002 Aug 1.)。
・非天然型アミノ酸がアジドフェニルアラニン:アミノアシル-tRNA合成酵素変異体がAzPheRS-1のY32T,E107N,D158P,I159L,L162Q変異体(Chin JW, Santoro SW, Martin AB, King DS, Wang L, Schultz PG. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J Am Chem Soc. 2002 Aug 7;124(31):9026-7.)。

【0058】
〔非天然タンパク質製造用の組換え細菌の抽出物、及び該抽出物を用いた非天然タンパク質の製造〕
非天然タンパク質の製造方法は、上述のように、無細胞タンパク質合成系を採用することもできる。例えば、Zubayら(Zubay et al., Ann. Rev. Genet. Vol.7, pp.267-287 (1973))、Prattら(Pratt,J.M.et al., Transcription and Translation - A practical approach, (1984), pp.179-209, Henes,B.D.et al. eds.,IRL Press, Oxford)、又はKigawaら(Kigawa, T. et al, J. Struct. Funct. Genomics, Vol.5, pp63-68 (2004))に開示の方法に従って組換え細菌株の抽出液を調製し、該抽出液の中で、非天然タンパク質を製造してもよい。

【0059】
したがって、非天然タンパク質の製造に用いる組換え細菌の抽出物であって、前記組換え細菌が、UAGコドンを認識するtRNAを発現すること、前記tRNAを非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸によってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を発現すること、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるDNA構築物が導入されていること、及び/又は細菌染色体上の前記1以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されていること、前記翻訳終結因子をコードする遺伝子が欠損していることを特徴とする抽出物もまた、本発明の範疇に含まれる。

【0060】
非天然タンパク質製造用の組換え細菌の抽出物は、以下の調製方法を用いて調製することができる。非天然型アミノ酸に特異的なアミノアシル-tRNA合成酵素を生成することができる組換え細菌を培養し、遠心分離により回収する。回収した細菌を、洗浄し、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。細菌の不溶分画を遠心分離で除去し、インキュベーションする。このインキュベーションによって内在性の核酸(DNA及びRNA)を分解することができる。内在性の核酸は、インキュベーション溶液に、さらにカルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加することでさらに分解できる。インキュベーション後、透析によって内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシドなど除去して、抽出液を調製する。

【0061】
組換え細菌の抽出物を用いた非天然タンパク質の製造は、以下の製造方法を採用することができる。インビトロで調製したアンバーサプレッサーtRNAと、市販のtRNA画分と、鋳型DNA/RNAとを、組換え細菌の抽出物に加える。ここで、タンパク質及び製造系の種類に応じて、非天然型アミノ酸又はα-ヒドロキシ酸を加え、さらにエネルギー、イオン、緩衝液、ATP再生系、核酸分解酵素阻害剤、還元剤、ポリエチレングリコール、cAMP、葉酸類及び抗菌剤等を加えてもよい。また、鋳型としてDNAを用いる場合には、RNA合成系(基質、及びポリメラーゼなど)を加えることが好ましい。

【0062】
上述のとおり、本発明は、以下の形態でもあり得る。

【0063】
(形態3)
形態1または形態2の作製方法において、前記細菌が、UAGコドンを認識するtRNAであって前記アミノアシル-tRNA合成酵素によってはアシル化されないtRNAを発現しており、当該tRNAをコードする遺伝子を欠損させるステップをさらに含む作製方法もまた可能である。

【0064】
(形態4)
形態1または形態2の作製方法において、前記非天然タンパク質が非天然型アミノ酸あるいはα-ヒドロキシ酸を含む非天然タンパク質であることが好ましい。

【0065】
(形態5)
また、前記細菌が大腸菌であることが好ましい。

【0066】
(形態6)
また、前記1以上の遺伝子が、UAGコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、単独で遺伝子欠損させると細菌が致死になる遺伝子であることが好ましい。

【0067】
(形態7)
また、前記細菌が大腸菌であり、前記1以上の遺伝子が、coaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolAの中から選択される1以上の遺伝子であることが好ましい。

【0068】
(形態8)
また、前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolAの中から選択される任意の6つの遺伝子であることが好ましい。

【0069】
(形態9)
また、前記1以上の遺伝子が、大腸菌のcoaD、hda、mreC及びhemAの遺伝子であることが好ましい。

【0070】
(形態10)
また、前記1以上の遺伝子として、遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が低下する遺伝子をさらに含むことが好ましい。

【0071】
(形態11)
また、遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が低下する上記遺伝子が、大腸菌のsucB遺伝子であることが好ましい。

【0072】
(形態12)
また、前記細菌が大腸菌であり、前記DNA構築物は、coaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK及びlolAの中から選択される1以上の遺伝子の機能を発現するDNA構築物であることが好ましい。

【0073】
(形態13)
また、前記DNA構築物は、さらに大腸菌のsucB遺伝子の機能を発現するDNA構築物であることが好ましい。

【0074】
(形態14)
また、前記DNA構築物は、細菌染色体にトランス及び/又はシスに補充されるバクテリア人工染色体、プラスミドあるいは直鎖状DNAであることが好ましい。

【0075】
(形態17)
形態16の組換え細菌において、前記組換え細菌が大腸菌由来であることが好ましい。

【0076】
(形態19)
形態18の製造方法において、前記組換え細菌が大腸菌由来であることが好ましい。

【0077】
(形態21)
形態20の抽出物において、前記組換え細菌が大腸菌由来であることが好ましい。

【0078】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【0079】
〔実施例1〕
[コンディショナルprfA変異株の作製]
prfA遺伝子を欠損させた大腸菌が生育するために必要な遺伝子を同定するために、本願発明者らは、コンディショナルprfA変異株を作製した(図1参照)。図1に示すようにprfA遺伝子を欠損させることにより、終止コドン部位におけるサプレッサーtRNAとの拮抗をなくすことができる。ここで、コンディショナルprfA変異株とは、L-アラビノースの存在下ではprfA遺伝子の発現が誘導され、D-グルコースの存在下ではprfA遺伝子の発現が抑制される変異株を意味する。
【実施例】
【0080】
コンディショナルprfA変異株のグルコース存在下での生育状態を図2のレーン1及びレーン2に示している。図2のレーン1及び2に示すように、コンディショナルprfA変異株は、グルコースの存在下では生育しなかったが(レーン1)、恒常的にprfA遺伝子を発現するプラスミドを導入したコンディショナルprfA変異株では、グルコースの存在下で生育した(レーン2)。
【実施例】
【0081】
次に、大腸菌のアンバーサプレッサーtRNAGln遺伝子又はアンバーサプレッサーtRNATyr遺伝子をコンディショナルprfA変異株に導入して、アンバーコドンが翻訳されるようにした。しかしながら、図2のレーン4(アンバーサプレッサーtRNAGlnを導入)及びレーン5(アンバーサプレッサーtRNATyrを導入)に示すように、何れのtRNAもグルコースの存在下でのコンディショナルprfA変異株の生育をサポートしなかった。一般的には、C末端に余分なペプチドを含むタンパク質は毒性を発揮しないが、余分なペプチドの付加がタンパク質の機能を欠損させることがある。そのため、アンバーサプレッサーtRNAGln又はtRNATyrを導入したprfA変異株の成長は、アンバーコドンにおいて翻訳が終結せず、タンパク質に余分なペプチドが付加されたことによって、阻害されたと考えられる。
【実施例】
【0082】
この知見に基づいて、本発明者らは、UAGコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、単独で欠損させると致死になる7つの大腸菌の遺伝子(すなわち、coaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK、lolA)のアンバーコドンを他の終止コドンに置き換えることによって、余分なペプチドの付加に起因する大腸菌の致死性を克服できると考えた。そして、アンバーコドンがオーカーコドン又はオパールコドンに置き換えられたこれら7つの遺伝子を発現するBACプラスミドであるBAC7を作製した。BAC7の作製方法を以下に示す。
【実施例】
【0083】
[BAC7の作製、及びBAC7の導入]
まず、miniFレプリコン及びゼオシン耐性遺伝子を有するBACプラスミドであるBAC0を、Motohashiら(Motohashi,T.,et al., Biochem Biophys Res Commun, Vol.326, pp.564-569 (2005))に開示の方法に従って調製した。そして、ftsI遺伝子、murE遺伝子、murF遺伝子、waaA-coaDのオペロン、mreB-mreC-mreDのオペロン、ycaI-msbA-lpxKのオペロン、hda遺伝子、hemA遺伝子、hemK遺伝子、及びlolA遺伝子を、BL21(DE3)からクローニングした。クローニングされたcoaD、murF、hda、mreC、lpxK、lolA、hemAの各遺伝子のアンバーコドン(TAG)をオーカーコドン(TAA)に置き換える変異をPCRを用いて導入した。変異を導入したオペロン(又は変異遺伝子)をBAC0に導入して、BAC7を作製した。各オペロン及び各遺伝子の導入位置及び導入方向の概略を図3に示す。図3の「gent」は、ゲンタマイシン耐性遺伝子を意味する。また、遺伝子名を囲んでいる矢印の向きは遺伝子の方向(5’から3’へ)を示しており、遺伝子名を含んでいない矢印は、転写プロモーターを示しており、その矢印の向きは転写の方向を示している。
【実施例】
【0084】
なお、BAC7は、coaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK、lolAの遺伝子、及びmreD、hemKの遺伝子を発現すればよく、任意の方法を採用して作製することができる。例えば、hemA-prfA-hemKのオペロンをクローニングし、そのオペロンからprfAを除去するようにしてもよい。オペロン又は遺伝子は、プロモーター領域からクローニングすることが好ましい。
【実施例】
【0085】
また、アンバーコドンがオーカーコドン又はオパールコドンに置き換えられたcoaD、murF、hda、mreC、lpxK、lolAの遺伝子及びhemKの遺伝子を発現するプラスミドを大腸菌に導入し、prfA遺伝子を欠損させるときに、ゲノム上のhemA遺伝子のアンバーコドンを、オーカーコドン又はオパールコドンに置き換えてもよい。
【実施例】
【0086】
作製したBAC7を、エレクトロポレーション法によってコンディショナルprfA変異株にトランスに導入した。
【実施例】
【0087】
BAC7を導入したコンディショナルprfA変異株のグルコース存在下での生育状態を図2のレーン6-10に示している。図2のレーン6-8に示すように、コンディショナルprfA変異株は、BAC7のみを導入した場合には生育できなかったが(レーン6)、アンバーサプレッサーtRNAGln遺伝子及びBAC7を導入した場合(レーン7)並びにアンバーサプレッサーtRNATyr遺伝子及びBAC7を導入した場合(レーン8)には、コンディショナルprfA変異株は生育できた。また、図2のレーン9及び10に示すように、大腸菌のアンバーサプレッサーtRNA遺伝子の代わりに、3-ヨードチロシンをタンパク質に導入するための古細菌の遺伝子のペアを導入した場合であっても、コンディショナルprfA変異株は生育でき(レーン9)、培地への3-ヨードチロシンの添加によってコンディショナルprfA変異株の生育能力は改善された(レーン10)。ここで、「古細菌の遺伝子のペア」とは、メタノカルドコッカス・ジャナシイ(Methanocardococcus jannaschii)由来のアンバーサプレッサーtRNA遺伝子、及びチロシル-tRNA合成酵素(TyrRS)変異体(engineered tyrosyl-tRNA synthetase)をコードするIYRS遺伝子のペアである(Sakamoto,K.,et al., Structure, Vol.17, pp.335-344 (2009))。
【実施例】
【0088】
図2の結果は、アンバーコドンを有する314個の遺伝子の中で、2%の遺伝子のアンバーコドンを改変し、内在性又は直交性のアンバーサプレッサーtRNAを発現させることで、prfA遺伝子を欠損させたことによる大腸菌の致死性を克服できることを示唆する。
【実施例】
【0089】
[prfA遺伝子の破壊株の作製]
次に、大腸菌HST08株にBAC7を形質導入し、prfA遺伝子の主要部分(51-858nt)をゼオシン耐性遺伝子で置き換えることによって、prfA遺伝子を欠損させた。ここで、HST08とは、アンバーサプレッサーtRNAGlnをコードするsupE44遺伝子を有する大腸菌である。
【実施例】
【0090】
prfA遺伝子は、以下の遺伝子破壊方法を用いて欠損させた。ゼオシン耐性遺伝子(Invitrogen)の5’末端及び3’末端に、それぞれ、RF-1のN末端に対応する50塩基対のDNA配列及びRF-1のC末端に対応する225塩基対のDNA配列をセンス方向で連結し組換え用フラグメントを作製した。得られたフラグメントを大腸菌HST08の染色体に挿入した。BAC7が導入されている大腸菌において、prfA遺伝子とゼオシン耐性遺伝子を含む組換え用フラグメントとの相同性組み換えを行うことによって、prfA遺伝子を欠損させた。このprfA遺伝子欠損株を、以下、RFzero-qと呼ぶ。なお、prfA遺伝子の遺伝子破壊は、本破壊方法に限定されず、周知の遺伝子破壊方法によって欠損させればよい。
【実施例】
【0091】
prfA遺伝子の欠損をPCRによって確認した。結果を図4に示す。図4(a)は遺伝子の置き換えの概略及び確認のPCRのためのプライマーの位置を示した図であり、図4(b)は、PCR産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。図4(b)のレーン1は、HST08における全長prfAのバンドを示し、図4(b)のレーン2は、RFzero-qにおける全長prfAに対応するバンドを示す(図4(a)における矢印P1,P2に示されるプライマーセットを使用して増幅)。図4(b)のレーン3は、HST08のゲノムDNAを用いてprfAの中央領域を増幅した場合に検出されるバンドを示し、図4(b)のレーン4は、RFzero-qのゲノムDNAを用いてprfAの中央領域を増幅した場合の検出結果を示す(図4(a)における矢印P3,P4に示されるプライマーセットを使用して増幅)。図4に示される結果から、prfA遺伝子の欠損が確認できた。また、600nmにおける吸光度を測定することによって、各株の成長速度を測定した。その結果、BAC7を導入した大腸菌HST08株の増殖速度は、1.3h-1であったのに対し、RFzero-q株の増殖速度は、0.9h-1であった。
【実施例】
【0092】
RFzero-q株がアンバーコドンにグルタミン酸を導入できることを確認するために、ORF内に3つのアンバーコドンを有するクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(cat)の変異遺伝子(cat(3Am)、と呼ぶ)でRFzero-q株を形質転換した。cat(3Am)のアミノ酸配列を図5(a)に示す。図5(a)のアミノ酸配列中の「X」は、cat(3Am)におけるアンバーコドンの位置を示し、RFzero-q株においてはグルタミン酸となる(配列番号17)。図5(c)は、cat(3Am)形質転換体におけるクロラムフェニコール(Cm)耐性を調べた結果を示す図である。図5(c)に示すように、野生型cat、及びcat(3Am)で形質転換されたRFzero-q株は、培地中のクロラムフェニコール濃度が400μg/mLまで、クロラムフェニコール(Cm)耐性を示した。
【実施例】
【0093】
さらに、ORF内に10個のアンバーコドンを有するcatの変異遺伝子(cat(10Am)、と呼ぶ)でRFzero-q株を形質転換した。cat(10Am)のアミノ酸配列を図5(b)に示す。図5(b)に示す配列中の「X」は、cat(10Am)におけるアンバーコドンの位置を示し、RFzero-q株においてはグルタミン酸となる(配列番号18)。図5(c)に示すように、cat(10Am)で形質転換されたRFzero-q株は、培地中のクロラムフェニコール濃度が200μg/mLまでCm耐性を示した。グルタミン酸コドンの翻訳効率が、アンバーコドンへのグルタミン酸の導入効率よりも優れるため、cat(10Am)を導入したRFzero-q株では、Cm耐性が落ちたと考えられる。一方では、図5(b)に示すように、cat(10Am)を導入したHST08は、10μg/mLのCmが培地中に存在するだけで、生育できなかった。
【実施例】
【0094】
図5に示す結果は、複数のアンバーコドンにグルタミン酸が組み込まれたことを示唆する。また、HST08にBAC7を導入し、prfA遺伝子を欠損させることによって、アンバーコドンへのグルタミン酸の導入効率が劇的に改善されたことを実証する。
【実施例】
【0095】
[非天然タンパク質製造用の組換え大腸菌の作製]
RFzero-q株のsupE44遺伝子を、大腸菌アンバーサプレッサーtRNATyr遺伝子で置き換えて、RFzero-y株を作製した。また、3-ヨードチロシンの存在下で、RFzero-q株のsupE44遺伝子を、上述の古細菌の遺伝子のペアで置き換えて、RFzero-iy株を作製した。具体的には、以下の形質転換方法を用いて、大腸菌を非天然タンパク質製造用の組換え大腸菌(RFzero-iy)に形質転換した。メタノカルドコッカス・ジャナシイのアンバーサプレッサーtRNA(MJR1変異体)と、この直交系アンバーサプレッサーtRNAに3-ヨードチロシンを付加するアミノアシル-tRNA合成酵素との組合せを発現するプラスミド(piodoTyrRS-MJR1)のカナマイシン耐性誘導体(piodoTyrRS-MJR1-kan)(Sakamoto,K.,et al., Structure, Vol.17, pp.335-344 (2009))をRFzero-qに導入した。
【実施例】
【0096】
なお、メタノカルドコッカス・ジャナシイのtRNATyrは、上記で採用したMJR1変異体に限定されず、例えば、J17変異体(Wang L, Schultz PG. A general approach for the generation of orthogonal tRNAs. Chem Biol. 2001 Sep; 8(9):883-90)を採用してもよい。
【実施例】
【0097】
RFzero-iy株の生育速度の測定結果を図6に示す。図6中、「+IY」は、3-ヨードチロシン存在下での生育を、「-IY」は、3-ヨードチロシン非存在下での生育を示している。図6に示すように、RFzero-iy株の生育速度は、3-ヨードチロシンの存在に依存した。図6の結果は、図2の結果と合致する。
【実施例】
【0098】
[非天然タンパク質の製造方法]
次に、6つのアンバーコドンをN端付近に導入したグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)遺伝子(gst(6Am)と呼ぶ)をtacプロモーターの制御によって発現する変異GST発現システムを作製し、該変異GST発現システムをRFzero-q株、RFzero-y株、及びRFzero-iy株に導入した。図7(a)は、gst(6Am)のN端側の45アミノ酸残基の配列を示している。図7(a)に示す配列中のアステリスクは、gst(6Am)におけるアンバーコドンの位置を示す。このアンバーコドンの位置にグルタミン酸、チロシン及び3-ヨードチロシンが導入されている各gst(6Am)のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号19~21に示している。
【実施例】
【0099】
変異GST発現システムを導入した各株(30μLカルチャー)からgst(6Am)タンパク質を取得し、SDS-PAGEにかけ、抗GST抗体を用いてウエスタンブロッティングした(図7(b)参照)。
【実施例】
【0100】
また、取得したgst(6Am)タンパク質をトリプシン処理し、質量分析によって解析した。RFzero-iy株から取得したgst(6Am)タンパク質の解析結果を図7(c)に示し、RFzero-q株及びRFzero-y株から取得したgst(6Am)タンパク質の解析結果をそれぞれ図8(a)及び(b)に示す。図7(c)に示すように、質量分析の結果から、RFzero-iy株は、5つの3-ヨードチロシンを含むペプチドA:DP*S*S*S*S*SNSGVTK(配列番号22)と、1つの3-ヨードチロシンを含むペプチドB:NP*SSPILGYWK(配列番号23)を生産したことがわかった。ここで「*」は、gst(6Am)タンパク質におけるアンバーコドンの位置を示し、3-ヨードチロシンが導入されている。また、図8に示すように、RFzero-q株、及びRFzero-y株も、6つのアンバーコドンに対応する位置にグルタミン酸、及びチロシンを含むペプチドを各々生産したことがわかった。RFzero-q株から取得したタンパク質の解析により得られたアミノ配列を配列番号24及び25に示し、RFzero-y株から取得したタンパク質の解析により得られたアミノ配列を配列番号26及び27に示す。
【実施例】
【0101】
上述のように、UAGコドンを認識するtRNAを大腸菌内で発現させ、このtRNAを非天然型アミノ酸である3-ヨードチロシンによってアシル化するアミノアシル-tRNA合成酵素を発現させ、prfA遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される1以上の遺伝子の機能を発現させるDNA構築物(例えば、BAC7)を大腸菌に導入し、大腸菌のprfA遺伝子を欠損させることによって、非天然タンパク質製造用の大腸菌が作製できることがわかった。
【実施例】
【0102】
以上のように、本発明の非天然タンパク質製造用の大腸菌の作製方法を使用すれば、大腸菌のprfA遺伝子を容易に欠損させることができるので、所望の大腸菌を用いた非天然タンパク質の製造効率を容易に向上させることができる。また、本発明の大腸菌は、効率よく非天然型アミノ酸をタンパク質に導入することができる。また、本発明の非天然タンパク質の製造方法を用いれば、効率よく非天然タンパク質を製造することができる。
【実施例】
【0103】
本発明は、大腸菌のprfA遺伝子を容易に欠損させることができるので、大腸菌株のライブラリーを利用して、多様なprfA欠損株を作製できる。それによって、非天然タンパク質を製造するときに、目的のタンパク質に応じて最適なprfA欠損株を選択することができる。そのため、本発明は、汎用性が低い大腸菌を使用する場合よりも、効率の良い非天然タンパク質の製造が期待できる。
【実施例】
【0104】
〔実施例2〕
実施例1では、3-ヨードチロシンが導入された非天然タンパク質製造用の大腸菌の作製方法などについて説明した。しかしながら、本発明は、3-ヨードチロシンに限定されず、任意の非天然型アミノ酸を採用することができる。本実施例では、非天然型アミノ酸として4-アジドフェニルアラニンを導入する非天然タンパク質を製造する組換え大腸菌を作製し、この組換え大腸菌を用いて非天然タンパク質を製造した。
【実施例】
【0105】
本実施例では、IYRS遺伝子の代わりに、アンバーサプレッサーtRNAに4-アジドフェニルアラニン付加するアミノアシル-tRNA合成酵素であるメタノコッカス・ジャナシイ(Methanococcus jannaschii)のAzFRS遺伝子(Chin JW, Santoro SW, Martin AB, King DS, Wang L, Schultz PG. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J Am Chem Soc. 2002 Aug 7;124(31):9026-7.)を導入して、RFzero-azf株を作製した。IYRS遺伝子の代わりにAzFRS遺伝子を導入した以外は実施例1と同様である。
【実施例】
【0106】
変異GST発現システムを導入した各株(30μLカルチャー)からgst(6Am)タンパク質を取得し、SDS-PAGEにかけ、抗GST抗体を用いてウエスタンブロッティングした。結果を図9に示す。
【実施例】
【0107】
図9に示すように、RFzero-azf株は、全長のgstを発現している。したがって、IYRS遺伝子の代わりにAzFRS遺伝子を導入したRFzero-azf株は、アンバーコドンへ4-アジドフェニルアラニンを導入することができたことを示している。すなわち、本発明は、任意の非天然型アミノ酸を採用することができる。
【実施例】
【0108】
〔実施例3〕
上述の実施例では、UAGコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、単独で欠損させると致死になる大腸菌の7つの遺伝子全てについて、その機能が発揮できるようにしていた。
【実施例】
【0109】
本実施例では、BACに導入する遺伝子を減らして、組換え細菌を作製した。具体的には、単独で欠損させると致死になる大腸菌の7つの遺伝子(coaD、murF、hda、mreC、hemA、lpxK、lolA)のうちのhdaを除く他の6つの遺伝子の何れかを含んでいないBACプラスミドを調製し、このBACプラスミドを導入した大腸菌について、prfA遺伝子を欠損させた。使用した大腸菌はHST08株である。結果を図10に示す。
【実施例】
【0110】
図10(a)は、遺伝子の置き換えの概略及び確認のPCRのためのプライマーの位置を示した図であり、図10(b)は、PCR産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。図10(b)は、図10(a)のP7,P8のプライマーセット又はP9,P10のプライマーセットで増幅した以下の株のフラグメント又はprfA遺伝子の欠損を示す、レーン1及び2:HST08+BAC7、レーン3及び4:RFzero-qのみ、レーン5及び6:RFzero-q+ΔmurF(murFを除く6種類の遺伝子を導入したBAC、以下同様)、レーン7及び8:RFzero-q+ΔcoaD、レーン9及び10:RFzero-q+ΔmreBCD、レーン11及び12:RFzero-q+ΔlpxK、レーン13及び14:RFzero-q+ΔhemAK、レーン15及び16:RFzero-q+ΔlolA。奇数レーンは図10(a)における矢印P5,P6に示されるプライマーセットを使用して増幅したものであり、偶数レーンは図10(a)における矢印P7,P8に示されるプライマーセットを使用して増幅したものである。
【実施例】
【0111】
図10に示す結果から、BACに導入する遺伝子(hdaを除く)を減らしても、増殖可能なprfA欠損株を作製できることが示された。
【実施例】
【0112】
また、waaA-coaDのオペロン、hda遺伝子、mreB-mreC-mreDのオペロン(又は変異遺伝子)のみを含むBAC3を作製し、HST08に導入した(図11参照)。次いで、prfA全長を除くように、prfA遺伝子をゼオシン耐性遺伝子で置換して、prfA遺伝子を欠損させた。なお、hemA遺伝子はゲノム上でprfA遺伝子に隣接しているため、prfA遺伝子を欠損させる組換えのときに、ゲノム上のhemA遺伝子のTAGコドン(終止コドン)をTAAに置き換えた。すなわち、単独で欠損させると致死になる遺伝子をトランスに導入する方法、及び染色体上の単独で欠損させると致死になる遺伝子のアンバーコドンを改変する方法を組み合わせている。
【実施例】
【0113】
図11(a)遺伝子の置き換えの概略及び確認のPCRのためのプライマーの位置を示した図であり、図11(b)は、PCR産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。図11(b)は、図11(a)の矢印P5,P6のプライマーセット又は矢印P7,P8のプライマーセットで増幅した、BAC3を導入した以下の株のフラグメント又はprfA遺伝子の欠損を示す、レーン1:HST08、レーン2:HST08、レーン3:HST08+BAC3+prfAの欠損、レーン4:HST08+BAC3+prfAの欠損。奇数レーンは図11(a)における矢印P5,P6に示されるプライマーセットを使用して増幅したものであり、偶数レーンは図11(a)における矢印P7,P8に示されるプライマーセットを使用して増幅したものである。
【実施例】
【0114】
図11に示す結果から、BACに導入する遺伝子(hdaを除く)を減らしても、増殖可能なprfA欠損株を作製できることが示された。
【実施例】
【0115】
また、UAGコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子として選択される1以上の遺伝子に、任意の遺伝子を付加することもできる。すなわち、BACに導入する遺伝子を減らした株には、成長速度が減少した株があった。そのため、遺伝子の数を増やした場合には、さらに大腸菌の生育速度及び/又は非天然タンパク質の製造効率が改善されることは容易に理解でき、本発明は、遺伝子の数を増やした実施形態も含む。増やす遺伝子としては、UAGコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、単独で遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が極端に低下する事が知られている遺伝子である事が望ましい。大腸菌においては、fliN,fliP,fliQ,sucB,ubiF,ulaF,atpE,fabHがこれに該当するがこれらに限らない。fliN,fliP,fliQ,sucB,ubiF,ulaF,atpE及びfabHの遺伝子の核酸配列を、それぞれ、配列番号9、10、11、12、13、14、15及び16に示す。なお、各配列番号によって表されているこれら遺伝子の核酸配列は、大腸菌K-12株のものであり、他の菌株においては塩基の置換が含まれる場合もあるが、それらも上記遺伝子として含まれる。増やす遺伝子の数としては、好適には1~30個、更に好適には1~20個、最も好適には1~10個である事が望ましい。
【実施例】
【0116】
〔実施例4〕
上述の実施例では、宿主細胞の細菌として大腸菌HST08株を使用した。しかしながら、他の大腸菌を使用してもよい。本実施例では、大腸菌HST08株の代わりに、K-12株であるHMS174(DE3)を使用して、非天然タンパク質製造用の組換え細菌(RFzero-iy)を作製した。また、メタノカルドコッカス・ジャナシイ由来のアンバーサプレッサーtRNA遺伝子及びIYRS遺伝子を含むペアの代わりに、GlnRS及びtRNAGlnCUAを導入した組換え細菌も作製した(RFzero-q)。
【実施例】
【0117】
まず、HMS174(DE3)にBAC6-ΔhemAKをトランスに導入した。ここで、BAC6-ΔhemAKは、BAC7プラスミドからhemAKオペロンをCATで置換して除いたBACプラスミドである。次いで、アンバーサプレッサーtRNA及び対応アミノアシル-tRNA合成酵素のペアをコードしているプラスミドを導入した。次いで、prfAをゼオシン耐性遺伝子で置換することにより、prfA遺伝子を欠損させた。なお、本実施例では、prfA全長が取り除かれるように、ゼオシン耐性遺伝子で置換した(図12(a)参照)。なお、本実施例においても、prfA遺伝子を欠損させる組換えのときに、ゲノム上のhemA遺伝子のTAGコドン(終止コドン)をTAAに置き換えている。
【実施例】
【0118】
なお、図2に示すように、UAGコドンを認識するtRNA(言い換えると、アンバーサプレッサーtRNA)及びこのtRNAをアミノアシル化する酵素を発現しない大腸菌は、BAC7を導入しただけでは、生育できない。そのため、UAGコドンを認識するtRNA及びこのtRNAをアミノアシル化する酵素を発現するように形質転換した後に、大腸菌のprfA遺伝子を欠損させることが好ましい。
【実施例】
【0119】
図12(a)は、prfA遺伝子の置き換えの概略及び欠損確認のPCRのためのプライマーの位置を示した図であり、図12(b)は、PCR産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。各レーンにおける鋳型DNAとした菌株は次の通りである;レーン1:HST08、レーン2:HST08、レーン3:HMS174(DE3)のRFzero-q、レーン4:HMS174(DE3)のRFzero-q、レーン5:HMS174(DE3)のRFzero-iy、レーン6:HMS174(DE3)のRFzero-iy。奇数レーンは図12(a)における矢印P5,P6に示されるプライマーセットを使用して増幅したものであり、偶数レーンは図12(a)における矢印P7,P8に示されるプライマーセットを使用して増幅したものである。図12に示される結果から、prfA遺伝子の欠損が確認できた。
【実施例】
【0120】
〔実施例5〕
本実施例では、UAGコドンで翻訳終結し、単独で遺伝子欠損させると細菌の増殖速度が極端に低下することが知られている遺伝子の中から、非天然タンパク質製造用の組換え大腸菌の増殖速度を向上させる遺伝子の探索を行った。候補遺伝子の探索には、BW25113株を使用した。BW25113株はKEIOコレクションの親株であり(Baba et al., Mol. Syst. Biol. 2, 2006.0008 (2006))、K-12株の野生型とほぼ同等である。候補遺伝子の探索のために、BW25113株からΔprfA株を作製した。具体的には、cat遺伝子を持つBAC6-ΔhemAKを導入し、supEとグルタミニル-tRNA合成酵素(GlnRS)とを発現するpGlnRS-supE-kan、又はpiodoTyrRS-MJR1-kanをさらに導入した後に、prfAをゼオシン耐性遺伝子で置換することにより、prfA遺伝子を欠損させた。なお、本実施例では、prfA全長が取り除かれるように、ゼオシン耐性遺伝子で置換した。なお、本実施例においても、prfA遺伝子を欠損させる組換えのときに、ゲノム上のhemA遺伝子のTAGコドン(終止コドン)をTAAに置き換えている。BW25113は野生株に近いため抗生物質に対する耐性が強く、ゼオシン75μg/mlで組換えコロニーのセレクションを行った。
【実施例】
【0121】
各候補遺伝子の終始コドンをPCRによってTAAに置換した後、pAp102ベクターにクローニングして各発現プラスミドを作製した。次いで、この発現プラスミドを用いて、上記のΔprfA株を形質転換した。その結果、候補遺伝子の一つであるsucBの発現系を導入した形質転換体は、30℃の液体培地中でとりわけよく増殖した。表1は、sucB発現プラスミド又はコントロールを、上記のΔprfA株であるBW25113[BAC6-ΔhemAK piodoTyrRS-MJR1-kan prfA::zeo hemA(TAG→TAA)]に導入し、単一コロニーを1晩30℃で振とう培養したときの増殖を調べた結果を示している。sucBはクエン酸回路を構成するα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼのE2サブユニットをコードする遺伝子である。野生型sucB遺伝子のUAGコドンは2つ連続しており、3-ヨードチロシンが連続して導入されることで、発現量あるいは活性が大幅に低下するものと考えられる。なお、プレート培養におけるコロニーはサイズがほとんど変わらなかったため、sucBの機能は、特に液性培地中での増殖能に寄与していると予想される。
【実施例】
【0122】
【表1】
JP0005858543B2_000002t.gif
【実施例】
【0123】
〔実施例6〕
本実施例では、大腸菌HST08株の代わりに、BW25113、K-12株であるHMS174(DE3)、及びB株由来のBL21(DE3)を使用して、かつBAC7プラスミドにsucB遺伝子を組み込んだプラスミドを用いて、非天然タンパク質製造用の組換え細菌(BW25113RFzero-iy、HMS174RFzero-iy、BL21RFzero-iy)を作製した。
【実施例】
【0124】
まず、終始コドンをTAAに置換したsucBをBAC7プラスミドへクローニングした。また、このプラスミドにおいてセレクションマーカーをcatに置換した。このプラスミドをBAC8プラスミドとした。BAC8における各オペロン及び各遺伝子の導入位置及び導入方向の概略を図13に示す。図13に示すとおり、catの終止コドンのすぐ下流にsucBがクローニングされている。そのため、sucBはcatプロモーターにより転写されることとなる。
【実施例】
【0125】
次に、BW25113、HMS174(DE3)、及びBL21(DE3)にBAC8を導入した。さらに、マーカー遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子からゲンタマイシン耐性遺伝子に変更している以外はpiodoTyrRS-MJR1-kanと同じであるpiodoTyrRS-MJR1-gentを、BAC8を導入した株に導入した。次いで、実施例5と同様にしてprfAをゼオシン耐性遺伝子で置換して、prfA遺伝子を欠損させた。それぞれのRFzero-iy株においてprfA遺伝子の欠損をPCRによって確認した結果を図14に示す。図14(a)は遺伝子の置き換えの概略及び確認のPCRのためのプライマーの位置を示した図であり、図14(b)は、PCR産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。コロニーPCRを行った結果、prfA遺伝子の欠損が確認できた(図14(b)参照)。以上から、BAC8を用いて、K-12株及びB株由来の大腸菌株において、容易にprfA遺伝子を欠損させることが可能であることが示された。
【実施例】
【0126】
得られたBW25113RFzero-iy、HMS174RFzero-iy、及びBL21RFzero-iyに関し、3-ヨードチロシンを含む培地における増殖速度を測定した。結果を図24に示す。その結果、BW25113RFzero-iy及びBL21RFzero-iyは、prfAであるこれらの親株とほとんど同程度の速度で増殖した(図24(a)及び(c))。一方、HMS174RFzero-iyは、prfAであるこの親株よりも緩やかに増殖した(図24(b))。
【実施例】
【0127】
さらに、各RFzero-iy株の増殖における非天然型アミノ酸の依存性について確認した。1晩培養した細胞培養物を希釈して、3-ヨードチロシンを含む非選択LB培地上、および3-ヨードチロシンを含まない非選択LB培地上にスポットしてさらに培養した。結果を図25に示す。図25に示されるように、いずれのRFzero-iy株の増殖も、3-ヨードチロシンの存在に完全に依存していた。このことは、prfAノックアウトにおける致死性を回避するためには細胞内におけるUAG翻訳活性が必要であることと整合している。
【実施例】
【0128】
〔実施例7〕
本実施例では、実施例6で作製したBW25113RFzero-iy株の性質を調べた。
【実施例】
【0129】
まず、BW25113RFzero-iy株の微量のグリセロールストックをLB液体培地、及び、3-ヨードチロシン(IY)、3-ブロモチロシン(BrY)又は3-クロロチロシン(ClY)のいずれかを添加したLB液体培地に加えて37℃で一晩振とう培養して、その増殖を調べた。結果を表2に示す。
【実施例】
【0130】
【表2】
JP0005858543B2_000003t.gif
【実施例】
【0131】
表2に示すとおり、非天然型アミノ酸を含まないLB液体培地では細胞増殖が全く見られなかった。一方、非天然型アミノ酸を加えた場合は、いずれの非天然型アミノ酸であっても、培養液の濁度がOD600=約1.4になり、十分に増殖することができた。すなわち、iodoTyrRS-mjは3-ヨードチロシン以外にも、3-ブロモチロシン及び3-クロロチロシンを認識することができた。
【実施例】
【0132】
以上から、BW25113RFzero-iy株においては、UAGコドンを3-ヨードチロシン、3-ブロモチロシン及び3-クロロチロシンのいずれにも割り当てることが可能であることが示された。HMS174(DE3)RFzero-iy及びBL21(DE3)RFzero-iyにおいても同様であると予想される。
【実施例】
【0133】
〔実施例8〕
上記の実施例2では、HST08株を宿主細胞の細菌として、3-ヨードチロシン以外の非天然型アミノ酸(4-アジドフェニルアラニン)を導入する非天然タンパク質製造用の組換え細菌(RFzero-azf)を作製した。本実施例では、宿主細胞の細菌としてBL21(DE3)を使用するとともに、3-ヨードチロシン以外の非天然型アミノ酸として、4-アジドフェニルアラニンのほかにO-スルホチロシンの導入も試みた。
【実施例】
【0134】
4-アジドフェニルアラニン又はO-スルホチロシンを導入する場合には、それぞれに特異的なアミノアシル-tRNA合成酵素である、メタノコッカス・ジャナシイのAzFRS遺伝子(AzFRS-mj)又はメタノコッカス・ジャナシイのSfYRS遺伝子(SfYRS-mj)(Liu, C.C. and Schultz, P.G., Nat. Biotechnol., 2006, 24, 1436-1440.)を発現させる必要がある。
【実施例】
【0135】
まず、pET21bベクターにgst(6Am)がクローニングされたプラスミドpETGST(6Am)に、AzFRS-mj又はSfYRS-mjの発現系をクローニングすることで、pETGST(6Am)-AzFRS-mj又はpETGST(6Am)-SfYRS-mjを作製した。なお、AzFRS-mj及びSfYRS-mjの活性を高めるために、新たにD286R変異(Kobayashi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, 4678-4683.)を導入した。
【実施例】
【0136】
次いで、実施例6で作製したBL21RFzero-iyを、pETGST(6Am)-AzFRS-mj又はpETGST(6Am)-SfYRS-mjによって形質転換し、4-アジドフェニルアラニン又はO-スルホチロシンを含むLBプレートにまき、コロニー形成を観察した。UAGコドンの割り当てを4-アジドフェニルアラニンに変更した株を、BL21RFzero-azfとし、O-スルホチロシンに変更した株をBL21RFzero-sfyとする。結果、BL21RFzero-azfのAzFプレート上での増殖速度は、IYプレート上でのRFzero-iyの増殖速度より遅く、SfYプレート上でのBL21RFzero-sfyの増殖速度は、IYプレート上でのRFzero-iyの増殖速度以上であった。なお、BL21RFzero-azf及びBL21RFzero-sfyは3-ヨードチロシンを含むLBプレート上ではほとんど増殖できない。これはAzFRS-mj及びSfYRS-mjが中程度コピープラスミドから発現するとともに、D286R変異によりM. jannaschiiのtRNATyrCUA分子を強く認識するため、低コピープラスミドから発現する弱いiodoTyrRS-mjからtRNAが奪われてしまうためだと考えられる。
【実施例】
【0137】
〔実施例9〕
実施例8において、BL21RFzero-sfyの増殖速度はBL21RFzero-azfの増殖速度よりも優れていた。AzFRS-mjの活性は他の変異体よりも弱いため、UAGコドンの翻訳効率とRFzero株の増殖速度とが相関している可能性が高い。そこで、過剰量のメタノコッカス・ジャナシイTyrRS変異体に対してメタノコッカス・ジャナシイtRNATyrCUA分子が不足していると予想されるため、さらにメタノコッカス・ジャナシイtRNATyrCUAの過剰発現系を導入することを試みた。AzFRS-mjの基質tRNAとして、pAzPhe1変異体が報告されており、アンバーサプレッション効率が3.6倍増加することが知られている(Guo et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2009, 48, 9148-9151.)。そこで、pETGST(25Am)にAzFRS-mj及びpAzPhe1の両方の発現系をクローニングした、pETGST(25Am)-AzFRS-mj-pAzPhe1を作製した。pAzPhe1はlppプロモーターから発現させた。lppプロモーターは強力なプロモーターとして知られている。
【実施例】
【0138】
実施例6で作製したBL21RFzero-iy株をpETGST(25Am)-AzFRS-mj-pAzPhe1によって形質転換し、4-アジドフェニルアラニン又は3-ヨードチロシンを含むLBプレートにまいた。結果を表3に示す。4-アジドフェニルアラニン入りプレート上において、BL21RFzero-azf(AzFRS-mj-pAzPhe1)株はBL21RFzero-azf(AzFRS-mj)株よりもはるかに生育がよく(表3中、カラム1vs3)、かつRFzero-iy株よりも生育がよかった(表3中、カラム1vs2)。また、BL21RFzero-azf(AzFRS-mj-pAzPhe1)株は3-ヨードチロシンを含むLBプレート上でも、増殖することができた(表3中、カラム4)。したがって、メタノコッカス・ジャナシイのTyrRS変異体/tRNATyrCUAペアを中程度コピー数のプラスミドに載せてBL21(DE3)RFzero-iy株に導入することにより、UAGコドンを、さらに他の非天然型アミノ酸に再定義できることが示された。
【実施例】
【0139】
【表3】
JP0005858543B2_000004t.gif
【実施例】
【0140】
次に、BW25113RFzero-iy株を用いて確認実験を行った。gstをtacプロモーター下流につないだpTacGSTプラスミドに、それぞれiodoTyrRS-mj-Nap3発現系、AzFRS-mj-pAzPhe1発現系、及びSfYRS-mj-Nap3発現系を載せた、pTacGST-iodoTyrRS-mj-Nap3、pTacGST-AzFRS-mj-pAzPhe1、及びpTacGST-SfYRS-mj-Nap3を作製した。Nap3は後述するように、tRNATyrCUAの高活型変異体である。また、いずれのaaRSもD286変異を有するものである。BW25113RFzero-iy株をこれら3種類のプラスミドのいずれかによって形質転換し、得られた形質転換体のコロニーを10倍ずつ段階希釈して、それぞれ非天然型アミノ酸有り、及び非天然型アミノ酸無しのLBプレートにスポットした。結果を図15に示す。
【実施例】
【0141】
図15に示されるように、いずれの形質転換体も、非天然型アミノ酸を含むプレート上でのみ増殖が見られ、非天然型アミノ酸を含まないプレート上では一切増殖しなかった。以上から、BW25113RFzero-iy株においても、BL21(DE3)RFzero-iy株と同様に、UAGコドンをさらに他の非天然型アミノ酸に再定義できることが示された。
【実施例】
【0142】
〔実施例10〕
上述の実施例から、RFzero-iy株の増殖速度を向上させるためには、iodoTyrRS-mj/tRNATyrCUAペアを改良すればよいことが示唆される。そこで、本実施例では、pAzPhe1変異体のように高活性であり、多くのメタノコッカス・ジャナシイTyrRS変異体に対して優れた基質であると予想されるNap3変異体を採用した。なお、pAzPhe1はNap3のC16が欠損したものである(Guo et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2009, 48, 9148-9151.)。
【実施例】
【0143】
まず、gst(73Am)変異体がクローニングされたpTacGST(73Am)プラスミドに、iodoTyrRS-mj(D286R)及びNap3の発現系を組み込んだ、pTacGST(73Am)-iodoTyrRS-mj-Nap3を作製した。次いで、BW25113RFzero-iy株にpTacGST(73Am)又はpTacGST(73Am)-iodoTyrRS-mj-Nap3を導入し、3-ヨードチロシンを含むLBプレート上でのコロニー形成を観察した。結果を図16に示す。
【実施例】
【0144】
図16に示されるように、pTacGST(73Am)-iodoTyrRS-mj-Nap3を導入したRFzero-iy株(図16(b))はpTacGST(73Am)を導入したRFzero-iy株(図16(a))と比較して圧倒的に増殖能が高かった。以上より、UAGコドンの翻訳効率を高めることにより、RFzero-iy株の増殖速度を向上させることができることが示された。
【実施例】
【0145】
〔実施例11〕
上述の実施例から、RFzero-iy株の増殖速度を高めるには、sucBを正常に発現させ、UAGコドンの翻訳効率を高めればよいことが明らかとなった。そこで、本実施例では、これらの要素が増殖速度に与える効果を確認した。具体的には、増殖曲線を観察することで、増殖速度に与えるそれぞれの効果を見積もった。
【実施例】
【0146】
まず、HST08株由来のRFzero-iy株における効果を調べた。終止コドンをUAAに置換したsucB遺伝子を、アンピシリン耐性遺伝子の直下につなぎ、pBR322ベクターにクローニングした。同様に、iodoTyrRS-mj/Nap3ペアを、pBR322に、単独あるいはsucB発現系と共にクローニングした。次いで、RFzero-iy株をpBR322(vector)、sucB発現系プラスミド、sucB/iodoTyrRS-mj/Nap3発現系プラスミドによって形質転換した。得られた形質転換体の増殖速度を測定した。比較として、HST08[BAC7gent supE44::cat piodoTyrRS-MJR1-kan]株にpBR322又はaaRS/tRNA発現系プラスミドを導入し、同様にして増殖速度を測定した。結果を図17に示す。
【実施例】
【0147】
図17に示されるとおり、RFzero-iy株にpBR322ベクターを導入した場合には,図6に示す増殖曲線を再現し、OD600が0.4を超えるあたりで増殖速度を落とし、その後、そのままの速度で増え続けた。なお、20時間後には野生型よりも濁度が高くなるが、死滅細胞が多いようであり、正常に分裂を休止できないようであった。一方、RFzero-iy株にsucB発現系を導入すると、OD600が0.4を超えるあたりでも増殖速度が落ちず、最終的には野生型HST08株と同程度に増殖した。なお、sucB発現系に加えてiodoTyrRS-mj/Nap3発現系を導入した場合(図17中、「sucB & aaRS & tRNA」)には、BW25113株とは異なり、増殖速度をさらに高めることはなかった。形質転換コロニーの形状にも変化が見られないことから、HST08株のRFzero-iy株においては、UAGの翻訳効率は既に十分に高いことが予想される。
【実施例】
【0148】
ところで、野生型のHST08株においてiodoTyrRS-mj/Nap3ペアを過剰発現させた場合には、わずかながら増殖速度が低下するものの、報告されている通り(Guo et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2009, 48, 9148-9151.)、Nap3変異体は大量発現させても細胞毒性がでにくいことが確認された。
【実施例】
【0149】
次に、HST08株由来のRFzero-iy株と同様にして、BW25113由来のRFzero-iy株における効果を確認した。具体的には、BW25113[BAC6-hemAK piodoTyrRS-MJR1-kan prfA::zeo hemA(TAG→TAA)]株をpBR322、sucB発現系プラスミド、又はsucB/iodoTyrRS-mj/Nap3発現系プラスミドによって形質転換し、それぞれの増殖速度を測定した。比較として、BW25113[BAC6-hemAK piodoTyrRS-MJR1-kan]株に、pBR322又はiodoTyrRS-mj/Nap3発現系プラスミドを導入し、同様にして増殖速度を測定した。結果を図18に示す。
【実施例】
【0150】
図18に示されるとおり、BW25113由来のRFzero-iy株においてsucBを発現させたところ、増殖速度が速まるのではなく、増殖速度は維持されていた。一方、sucB発現系に加えてiodoTyrRS-mj/Nap3発現系を導入した場合(図18中、「sucB & aaRS & tRNA」)には、HST08株とは異なり、劇的な増殖速度の回復が見られ、ΔprfA株でありながら、野生株に近い増殖曲線が観察された。また、形質転換コロニーの形状も、野生株における形状に非常に類似していた。
【実施例】
【0151】
HST08から作製したRFzero-iy株とBW25113から作製したRFzero-iy株とを比較すると、HST08RFzero-iy株においては、UAGの翻訳効率ではなく、sucBの低活性化が増殖を妨げており、一方、BW25113RFzero-iy株においては、sucBの低活性化に加え、UAGの翻訳が間に合っていないことが増殖を妨げていたことが明らかとなった。さらに、BL21(DE3)株においては、BAC7を用いてBL21(DE3)RFzero-iy株を作製でき、プレート培養が可能であるものの、液体培養を含む通常の遺伝子作業に用いるには、BAC8を用いたり、トランスにsucB発現系を導入したりするなど、sucB発現系を補充することがより望ましいことが明らかとなった。
【実施例】
【0152】
〔実施例12〕
本実施例では、ORF中にUAGコドンを含むgst変異体の発現を確認した。
【実施例】
【0153】
まず、pTacGST(73Am)-iodoTyrRS-mj-Nap3上のgst(73Am)変異体において、さらに22、57、141、155及び163残基目のいずれかのチロシンコドンをUAGに置換し、UAGコドンが2か所に導入されたシリーズを作製した。比較として、野生型gstを同様にクローニングして、pTacGST-iodoTyrRS-mj-Nap3を作製した。BW25113RFzero-iy株に、上記シリーズのうちのいずれか、又はpTacGST(73Am)-iodoTyrRS-mj-Nap3、又はpTacGST-iodoTyrRS-mj-Nap3を導入し,全長GSTの発現を、抗GST抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。結果を図19に示す。
【実施例】
【0154】
図19に示されるように、野生型gstの発現と比較し、gst(73Am)変異体も、さらなるUAGコドンを導入した各変異体も同程度に発現していた。すなわち、UAGコドンが3-ヨードチロシンとして効率良く翻訳されていることが示された。さらに、UAGの位置で翻訳終結した断片は検出されなかったため、UAGは完全なセンスコドンになっていることが明らかとなった。
【実施例】
【0155】
次に、gstの1(gst(25Am)に相当)、22、57、73、141、155、163残基目のアミノ酸のコドンを全てUAGコドンに置換した、pTacGST(7Am)-iodoTyrRS-mj-Nap3を作製した。当該コンストラクトをBW25113RFzero-iy株に導入し、gstの発現を調べた。結果を図20に示す。
【実施例】
【0156】
図20に示されるように、野生型gst及びgst(7Am)の発現量をSDS-PAGEにより比較したところ、同程度の大量発現が観察された。したがって、BW25113RFzero-iy株は、増殖速度において野生株に匹敵し、UAGの翻訳効率においてもチロシンコドンに匹敵し、UAGコドンが完全に3-ヨードチロシンに再定義された生物種であることが明らかとなった。
【実施例】
【0157】
〔実施例13〕
本実施例では、BW25113株におけるUAGコドンを種々のチロシン誘導体およびリジン誘導体に割り当てることによって、非天然型アミノ酸の導入を試みた。具体的には、実施例6で作製したBW25113RFzero-iy株において、UAGコドンを種々のチロシン誘導体およびリジン誘導体に再定義することにより、非天然型アミノ酸の導入を試みた。
【実施例】
【0158】
本実施例において使用される古細菌のTyrRSおよびPylRSは、大腸菌において、所望の非天然型アミノ酸を、UAGコドンを認識するtRNAと結合させるように改変されている。具体的には、実施例8におけるAzFRS-mj、実施例8におけるSfYRS-mj、Nε-アセチル-L-リジン(AcLys)をペアとなるアンバーサプレッサーtRNA(Methanosarcina mazei tRNAPyl)に結合させるPylRS誘導体(上述のAcKRS-3)、Nε-アリルオキシカルボニル-L-リジン(AlocLys)またはNε-(o-アジドベンジルオキシカルボニル)-L-リジン(AzZLys)をペアとなるアンバーサプレッサーtRNA(Methanosarcina mazei tRNAPyl)に結合させるPylRS誘導体(Yanagisawa T.et al, Chem, Biol, 15, pp1187-1197 (2008))を使用した。本実施例で使用した非天然型アミノ酸の構造を図26に示す。
【実施例】
【0159】
RS誘導体のそれぞれを、ペアとなるアンバーサプレッサーtRNAとともに、BW25113RFzero-iyにおいて発現させた。なお、UAGコドンを3-ヨードチロシンに翻訳するRFzero-iyの内在性の系は、3-ヨードチロシンの非存在下においては機能しない。そのため、別のRS誘導体ペア-tRNAをコードするコンストラクトを導入してこれらを発現させ、対応する非天然型アミノ酸を添加することにより、RFzero-iyにおけるUAGコドンを3-ヨードチロシンから所望の非天然型アミノ酸に再定義することができる。
【実施例】
【0160】
各RS誘導体-tRNAペアを発現している株を、対応する非天然型アミノ酸を含む培地において増殖させ、その増殖速度を測定した。結果を図27に示す。その結果、4-アジドフェニルアラニン、O-スルホチロシン又はNε-アリルオキシカルボニル-L-リジンを導入するRS誘導体-tRNAペアを有しているBW25113RFzero-iy株(図27中、それぞれBW-azf、BW-sfy、及びBW-AlocLys)は、それぞれに対応する非天然型アミノ酸を含む培地において、親株のBW25113とほとんど同じ速度で増殖した。一方、Nε-(o-アジドベンジルオキシカルボニル)-L-リジンまたはアセチルリジンを導入するRS誘導体-tRNAペアを有しているBW25113RFzero-iy株(図27中、それぞれBW-AzZLys及びBW-AcLys)は、それぞれに対応する非天然型アミノ酸を含む培地において、親株のBW25113に比べ緩やかに増殖した。
【実施例】
【0161】
さらに、各RFzero-iy株の増殖における非天然型アミノ酸の依存性について確認した。1晩培養した細胞培養物を希釈して、対応する非天然型アミノ酸を含む非選択LB培地上、および対応する非天然型アミノ酸を含まない非選択LB培地上にスポットしてさらに培養した。結果を図28に示す。図28に示されるように、いずれのRFzero-iy株の増殖も、対応する非天然型アミノ酸の存在に完全に依存していた。このことから、UAGコドンに割り当てられたアミノ酸が3-ヨードチロシンから4-アジド-L-フェニルアラニン、O-スルホ-L-チロシン、Nε-アセチル-L-リジン、Nε-アリルオキシカルボニル-L-リジン、またはNε-(o-アジドベンジルオキシカルボニル)-L-リジンに切り替えられていることが示された。
【実施例】
【0162】
以上の結果から、様々な遺伝的バックグラウンドにおいて、および種々の非天然型アミノ酸を用いて、コドンの迅速な再割り当てを行うことが可能であることが示された。また、製造されたRFzero株の増殖は、大規模なタンパク質生産にあたって十分な増殖速度であることが示された。
【実施例】
【0163】
〔実施例14〕
本実施例では、BW25113のRFzero株におけるUAGコドンの割り当てを3-ヨードチロシン、4-アジドフェニルアラニン、またはO-スルホチロシンに変更した株(以下、それぞれを、BW25113RFzero-iy、BW25113RFzero-azfおよびBW25113RFzero-sfyと称する)において、非天然型アミノ酸が導入されたタンパク質が実際に合成されていることを確認した。
【実施例】
【0164】
まず、GST遺伝子における15のチロシンコドンのうちの3つまたは7つのチロシンコドンをUAGコドンに変更した改変GST遺伝子(gst(3×amb)、gst(7×amb))を発現させる発現プラスミド作成した。この改変GST遺伝子は、N末端に25の追加のアミノ酸が付加されている。gst(3×amb)においては、この25の追加アミノ酸を含めて数えて、25位、47位、および98位のチロシンコドンがUAGコドンに変更されている。また、gst(7×amb)においては、gst(3×amb)における変更位置に加えて、さらに82位、166位、180位、および188位のチロシンコドンがUAGコドンに変更されている。各改変GST遺伝子は、tacプロモータの制御下におかれている。また、各発現プラスミドには、UAGコドンの割り当てを3-ヨードチロシン、4-アジドフェニルアラニン、またはO-スルホチロシンに変更する発現ユニット(RS誘導体-tRNAペア)が組み込まれている。
【実施例】
【0165】
各発現プラスミドを、実施例6で作製したBW25113RFzero-iyに導入した。各株からタンパク質を取得し、SGS-PAGEにかけ、CBB染色するとともに、抗GST抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。結果を図29に示す。図29において、RFzero-azf及びRFzero-sfyは、それぞれBW25113RFzero-iyに対して、UAGコドンの割り当てを4-アジドフェニルアラニンに変更する発現ユニット及びUAGコドンの割り当てをO-スルホチロシンに変更する発現ユニットを導入した株である。図29中、上側の写真はCBB染色の結果を示しており、下側の写真はウエスタンブロッティングの結果を示している。図29に示すように、全ての株において、改変GST遺伝子の全長(図29中、矢印)が発現していることが確認された。なお、本実施例における「野生型のGST(WT)」は、N末端に25の追加のアミノ酸が付加されているGSTを指す。各レーンの下部にある数値は、見積もられた生成量(1Lの培養物あたりのmg)を示している。BW25113RFzero-iyにおけるgst(3×amb)およびgst(7×amb)の発現量は、野生型GSTの発現量とほぼ等しい発現量であった。BW25113RFzero-azfおよびBW25113RFzero-sfyにおけるgst(3×amb)およびgst(7×amb)の発現量は、野生型GSTの発現量よりも低下していた。しかしながら、このうち最も発現量が低かった、BW25113RFzero-sfyにおけるgst(7×amb)でさえも、培養物1Lにつきミリグラム単位の量の目的タンパク質を生成することができた。
【実施例】
【0166】
さらに、BW25113RFzero-iyにおけるgst(7×amb)産物を用いて、7つのヨードチロシンが確かにタンパク質内に導入されていることを、質量分析(ESI-MS)によって確認した。結果を図30に示す。確認の結果、BW25113RFzero-iy由来のGSTタンパク質の推定質量(28846.0Da)は、野生型のGSTタンパク質の推定質量(27966.0Da)よりも880Da大きい値であった。これは、7つの水素原子がヨウ素原子に置き換わったときの値に相当する。したがって、7つのチロシンがいずれも3-ヨードチロシンに置き換わっていることが確認された。
【実施例】
【0167】
翻訳機構または順応機序は、種々の非天然型アミノ酸に対して、異なる効率でもって機能することが知られている(Liu, C.C. and Schultz, P.G., Annu. Rev. Biochem., 79, 413-444 (2010))。そのため、タンパク質の生成量の低下は、4-アジドフェニルアラニンおよびO-スルホチロシンを用いたタンパク質合成の速度が3-ヨードチロシンを用いたタンパク質合成よりも緩やかであったためと考えられる。このことは、以下のprfAの株を用いた実験によっても確認された。
【実施例】
【0168】
ここでは、N末端近傍にUAGコドンを含むGST遺伝子を、非天然型アミノ酸を導入するための発現ユニットとともに、prfA株であるBW25113に導入し、その翻訳効率を確認した。N末端近傍にUAGコドンを含むGST遺伝子は、チオレドキシン(TRX)との融合タンパク質となるようにプラスミドに組み込まれている(図31(a)参照)。結果を図31(b)に示す。図31(b)は、抗Hisタグ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示している。図31(b)中、レーン2は、インフレームのUAGコドンを含んでいないGST遺伝子を導入した株であり、レーン1、4~6は、N末端近傍にUAGコドンを含む融合GST遺伝子を導入した株である。また、レーン1は、非天然型アミノ酸を導入するコンストラクトが含まれていない株である。レーン4~6に示されるように、UAGコドンを3-ヨードチロシン、4-アジドフェニルアラニン、またはO-スルホチロシンに割り当てるためのコンストラクトが導入された株は、対応する非天然型アミノ酸の存在下において、全長の融合タンパク質を生成することが示されている(図中、矢印A)。また、これらの株においては、UAGコドンにおける翻訳の中断により生じたタンパク質も生成されている(図中、矢印B)。各レーンの下部の括弧内に示した数字は、この翻訳中断により生じたタンパク質および生成された全長融合タンパク質の総量に対する全長融合タンパク質の割合(%)を示している。すなわち、UAGコドンにおける非天然型アミノ酸の導入効率を示している。2つのチロシン誘導体(4-アジドフェニルアラニン、およびO-スルホチロシン)に関しては、prfAの条件においても、3-ヨードチロシンよりも導入の効率が低いことが明らかとなった。なお、より多くの部位に非天然型アミノ酸を導入することによってタンパク質が不安定化した場合にも、タンパク質の生産量は低下するものと考えられる。
【実施例】
【0169】
〔実施例15〕
本実施例では、BL21(DE3)RFzero-iy株を利用して、特定の複数の部位にアセチルリジンを有しているヒストンを生成することを試みた。ヒストンH4は、10のリジン残基のうち、最大4つの特定のリジンが翻訳後にアセチル化されている。特定の位置において修飾されている均質なヒストンを合成する方法は、エピジェネティックの研究、および染色体の再構築に作用する治療薬の開発に有用である。
【実施例】
【0170】
具体的には、実施例6で作製したBL21(DE3)RFzero-iy株から細胞抽出物を調製して、これを用いた無細胞タンパク質合成系により、目的タンパク質の合成を試みた。無細胞タンパク質合成系においては、ニコチンアミドを高濃度で直接添加することができる。そのため、無細胞タンパク質合成系においては、脱アセチル化を防ぐことができ、これによりアセチル化に関して均質なヒストンを得ることができるためである。また、BL21株の細胞抽出物は、高いタンパク質生産性を示すことが知られている(Kigawa, T. et al, J. Struct. Funct. Genomics, Vol.5, pp63-68 (2004))。
【実施例】
【0171】
まず、BL21(DE3)RFzero-iyから細胞抽出物を調製した後、3-ヨードチロシンを取り除くために透析を行った。ついで、アセチルリジンをtRNAに結合させる、メタノサルシナ・マゼイ由来のPylRS誘導体、およびこの誘導体のペアとなる、アンバーサプレッサーtRNAを、細胞抽出物に添加した。また、終濃度10mMのニコチンアミドを添加した。
【実施例】
【0172】
ヒトのヒストンH4においてアセチル化される4つの部位(5位、8位、12位および16位)に対応するコドンを全てUAGに置換したヒトのヒストンH4改変遺伝子を用いて、発現用プラスミドを構築した。なお、この改変遺伝子においては、生成されるタンパク質のN末端にペプチドタグ(MKDHLIHNHHKHEHAHALVPRGSH:配列番号31)が付加されている。この発現用プラスミドを上記細胞抽出物に添加した。
【実施例】
【0173】
合成されたH4ヒストンタンパク質は不溶性画分として得られた。これを尿素を用いて溶解させた後、クロマトグラフィーにより精製した。
【実施例】
【0174】
その結果、H4ヒストン全長が生成されたことが確認できた。その収量は、反応液1mlにつき0.3mgであった。さらに、質量分析(ESI-MS)によって、H4ヒストンにおけるアセチルリジンの導入を確認した。結果を図32に示す。その結果、得られたH4ヒストンの推定質量(14356.0Da)は、未修飾のH4ヒストンの推定質量(14188.0Da)よりも168.0Da大きい値であった。これは、4つのアセチル基(計168.1Da)の追加に対応するものである。したがって、ヒストンH4に4つのアセチルリジンが導入されていることが示された。
【実施例】
【0175】
〔参考例〕
本参考例では、UAGコドンを翻訳するtRNA分子の改変によってRFzero-q株の増殖能力を向上させる方法を示す。
【実施例】
【0176】
(UAG翻訳効率を高めたsupE tRNA分子の作製)
実施例1で示された通り、cat(10Am)を導入したRFzero-q株は、野生型のcatで形質転換したRFzero-q株と比べCm耐性が落ちていた。これは、グルタミンのアンバーサプレッサー変異型tRNAによるUAGコドンの翻訳効率が、通常のグルタミンtRNAによるグルタミンコドン(CAA、CAG)の翻訳効率より低かったためと考えられる。ところで、supE44変異に対応するtRNAGlnのアンチコドンの三番目に変異を入れるとアミノアシル活性が低下することが知られている。HST08株由来のRFzero-q株は、アンバーサプレッサーtRNAGln(supE tRNA)をコードするsupE44遺伝子を有しているが、tRNAGlnのアンチコドン(CUG)の三番目(36位)に変異(G→A)が入っている。そこで、アミノアシルtRNA合成酵素を改変するのではなく、supE tRNA分子のUAG翻訳効率を改善することによってRFzero-q株の増殖能力を向上させることを試みた。
【実施例】
【0177】
図21(a)に示すように、supE tRNA遺伝子の30位~40位(アンチコドン部位(34~36位)を除く)にランダムに変異を入れてsupE tRNA変異体のライブラリーを構築した。3種類のDNAオリゴマーOLG1(配列番号28)、OLG2(配列番号29)及びOLG3(配列番号30)を用意し、以下の工程を経て2本鎖DNAを形成させた。
【実施例】
【0178】
50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM MgCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、4.7mM ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(10units)を含む反応混合物(20ml)に、OLG1又はOLG2(それぞれ200pmol)を加えて、37℃30分間処理し、それぞれ別々に5末端のリン酸化反応を行った。これらのオリゴマーを混合してから、OLG3(200pmol)を加えて、アニーリングを行った。アニーリングは、94℃で30秒間、80℃で1分間、74℃で1分間、65℃で30秒間、及び55℃で1分間の条件で行った。アニールしたオリゴマーの溶液から、簡易ゲルろ過法によってATPを除去した。
【実施例】
【0179】
アンチセンス鎖にはギャップが入っており、このギャップはセンス鎖のアンチコドン部位(CTA)と8箇所のランダム化した配列部位に対応する(図21(b)参照)。このギャップは形質転換後に細胞内のDNAポリメラーゼによって埋められる。
【実施例】
【0180】
tyrTプロモーターの下流に当該変異体遺伝子を組み込み、catの変異遺伝子(cat(3Am))及び3つのインフレームのUAGコドンを持つpKS3cat(3amb)-kanにクローニングした。得られたプラスミドによってサプレッサーtRNAを含まないDH10B株を形質転換し、カナマイシン(30μg/ml)を含むLB培地でコロニーのセレクションを行った。その結果、2×107のコロニー(supE tRNA変異体遺伝子ライブラリー)が得られた。23個のクローンのシーケンシングを行ったところ、15個のクローン(65%)が完全長のtRNA配列を有しており、残りはtRNA配列全体が欠失しているか、ランダム化した領域のヌクレオチドが欠失していた(図21(c)参照)。
【実施例】
【0181】
次に、150μg/mlのCmを含むLB培地上でsupE tRNA変異体遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、18個のクローンを得た。これらのクローンについて150-500μg/mlのCmを含むLB培地上でCm耐性能力を調べた。18個のクローンの配列についてシーケンシングしたところ、13種類の異なるtRNA塩基配列が認められた。supE-tRNA変異体は全てもとのsupE tRNAと比較して高いCm耐性を示した。この結果は、これらの変異体がもとのsupE tRNAと比較してUAGの翻訳効率が高いことを示している。また、これらの変異体全てにおいて、33位にU、37位にA、そして30位-40位間塩基対を有していた。これら3つの要素はUAGの効率的な翻訳に必要な要素と考えられる。
【実施例】
【0182】
上記の13種類のクローンのうち、クローン2、3、4、5、7、9、及び11が最も高いCm耐性を示した。クローン3は38位がUからAに置き換わっている以外はsupE tRNAと同じであった。この置換は、高いCm耐性を示した上位7クローンのうち、クローン2を除く全てに見られたことから、UAGの翻訳効率を更に向上させる働きがあると考えられる。
【実施例】
【0183】
クローン4及び7はもとのtRNAとは最も異なった配列を有していた(ランダム化した8箇所のうち、6箇所が置き換わっていた)。そこで、置換の数が最も少なかったクローン3(以下、「supE3 tRNA」と呼ぶ)、及び最も多かったクローン7(以下、「supE7 tRNA」と呼ぶ)を用いてRFzero-q株のUAG翻訳効率のさらなる向上を試みた。これらの変異体は38位がUからAに置き換わっている。しかし、2種類の大腸菌tRNAGlnの38位はUで不変部位であり、グルタミニルtRNA合成酵素によるtRNAGlnの認識に関わっている。実際、大腸菌tRNAGlnにおいてこの部位をUからGへ置換した結果、アミノアシル活性が低下したことが報告されている。このことから、supE3 tRNA及びsupE7 tRNAの高いUAG翻訳効率は、UAGを認識する能力がアミノアシル活性低下を十分打ち消す程度まで高められたことによるものと考えられる。
【実施例】
【0184】
(supE3 tRNA又はsupE7 tRNAを有するRFzero-q株の開発)
RFzero-q株の親株であるHST08株において、supE tRNAをコードする配列をsupE3又はsupE7に置き換えた、HST08-3株及びHST08-7株を作製した。相同性組み換えは、RT/ETキット(Gene Bridges社)を用いて行った。ゲンタマイシン耐性のBAC7であるBAC7gentをHST08-3及びHST08-7株に導入してprfA遺伝子のノックアウトを行い、RFzero-q3、RFzero-q7を作製した。なお、本実施例では、prfA遺伝子は全長のうちの大部分をゼオシン耐性遺伝子で置換した。最後に、HST08-3及びHST08-7株のゲノム上のprfA領域についてシーケンシングして、ゲノム中にprfAが残存していないことを確認した。
【実施例】
【0185】
(UAGコドンの翻訳効率の比較)
cat遺伝子にある13箇所のグルタミンコドンを全てUAGに置換したcat(13Am)をRFzero-q3株、RFzero-q7株それぞれに導入し、UAGコドンの翻訳効率が向上しているか確認した。RFzero-q株及びRFzero-q7株は200μg/mlのCmに対して耐性を示した。これは、野生型cat遺伝子の入ったpACYC184によって形質転換したHST08株及びRFzero-q株におけるCmに対する耐性(400μg/ml)よりも低かった。一方、RFzero-q3株では400μg/mlに近いCm濃度で耐性を示した。この結果は、RFzero-q3株におけるUAGコドンの翻訳効率が劇的に向上したことを示している。
【実施例】
【0186】
次に、グルタミンコドンへの再定義を行ったUAGとグルタミンコドン(CAG)との翻訳効率を比較した。まず、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)遺伝子のN末端に6つのUAGコドンを導入し(gst(6amb))、tacプロモーター下流につないで作製したpTacGST(6Am)によってRFzero-q株、RFzero-q3株、及びRFzero-q7株を形質転換した。比較対象として、UAGコドンの代わりにCAGコドンの入ったpTacGST(6gln)によって形質転換したRFzero-q株、RFzero-q3株及びRFzero-q7株を用意した。gst(6amb)及びgst(6gln)の発現量はSDS-PAGE及びウエスタブロットによって確認した。結果を図22(a)に示す。gst(6amb)を発現させたRFzero-q株はgst(6gln)を発現させた同株と比べて、その発現量が著しく低下していた。この結果は、UAGコドンの翻訳効率が、通常のグルタミンtRNAによるグルタミンコドン(CAA、CAG)の翻訳効率より低いという上述の見解を裏付けるものであった。一方、RFzero-q3株では、gst(6amb)及びgst(6gln)の発現量はほとんど同じであったのに対し、RFzero-q7株では、gst(6amb)の発現量がgst(6gln)と比較して若干低下していた。また、RFzero-q株、RFzero-q7株のgst(6gln)発現量はRFzero-q3株における発現量より低かった。これは、後述の通り、RFzero-q3株の増殖速度がRFzero-q株及びRFzero-q7株と比較して速いことに起因するものと思われる。
【実施例】
【0187】
次に、細胞抽出液のGST活性を測定し、gst(6gln)に対するgst(6amb)の相対収量を調べた。結果を図22(b)に示す。
【実施例】
【0188】
図22(b)に示されるとおり、prfA遺伝子をノックアウトしていない親株のHST08株では、supE tRNA遺伝子が発現していたにも関わらず、gst(6amb)遺伝子がほとんど発現していなかった。一方、prfA遺伝子をノックアウトしているRFzero-q株、RFzero-q3株及びRFzero-q7株においては、gst(6amb)収量が劇的に増加した。相対収量は、29%(RFzero-q株)、59%(RFzero-q7株)、及び89%(RFzero-q3株)であった。また、RFzero-q3株では、gst(6amb)の収量とgst(6gln)の収量とはほとんど同じであった。これらの結果は、RFzero-q3株及びRFzero-q7株においてUAG翻訳効率が劇的に向上し、RFzero-q3株ではグルタミンコドン(CAA、CAG)の翻訳効率とほぼ同程度まで向上したことを示している。
【実施例】
【0189】
(HST08株及びRFzero-q株の増殖率の比較)
HST08株及びRFzero-q株をそれぞれLB培地(抗生物質なし)中、37℃で培養し、増殖速度を比較した。結果を図23(a)に示す。RFzero-q株は親株であるHST08株と比べて増殖は遅かった。RFzero-q7株の増殖速度はRFzero-q株とほぼ同じであった。一方、RFzero-q3株はHST08株と同程度の増殖速度を有しており、supE3変異が大腸菌の増殖に好ましい影響を与えていることが示された。
【実施例】
【0190】
RFzero株では、prfB遺伝子にコードされているRF-2が唯一の終結因子であり、UGAコドン及びUAAコドンを認識する。RF-2に変異を入れることにより、UGA及びUAAに加えてUAGを翻訳させることが可能であるとの報告がされている。もし、RFzero-q株のRF-2に変異が入っている場合、欠失したRF-1の働きをRF-2が補ってしまう可能性がある。そこで、増殖速度の向上がRF-2の変異によるものではないことを確認するため、RFzero-q3株のゲノム上のprfB領域についてシーケンシングを行った。その結果、prfBに変異が入っていないことが確認された。
【実施例】
【0191】
さらに、HST08株及びRFzero-q3株をより厳しい条件下で培養し、増殖速度を比較した。結果を図23(b)及び(c)に示す。LB培地中、37℃では対数増殖していた両株を、42℃の条件下に移して増殖率を比較したところ、最初の1時間は増殖率をほとんど変化させずに対数増殖したが、2時間後は両株の増殖率にほとんど差が見られなくなった(図23(b)参照)。一方、M9塩、グリセロール及びマグネシウム塩のみを含む栄養欠乏培地では、HST08株はゆっくり増殖したのに対し、RFzero-q3株はほとんど増殖しなかった(図23(c)参照)。これらの結果は、UAGコドンの読み飛ばしによって、飢餓状態での成長に重要な遺伝子の活性が低くなったことが原因と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【0192】
本発明によれば、非天然タンパク質の合成を日常的な基礎技術に採用することができ、それによって、医薬品生産、タンパク質の機能解析、酵素の改変、大腸菌の改変などの発展が期待される。
Drawing
(In Japanese)【図3】
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(In Japanese)【図6】
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(In Japanese)【図8】
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(In Japanese)【図13】
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(In Japanese)【図17】
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(In Japanese)【図18】
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(In Japanese)【図21】
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(In Japanese)【図24】
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(In Japanese)【図26】
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(In Japanese)【図27】
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(In Japanese)【図30】
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(In Japanese)【図1】
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(In Japanese)【図5】
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(In Japanese)【図9】
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(In Japanese)【図10】
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(In Japanese)【図12】
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(In Japanese)【図14】
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(In Japanese)【図15】
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(In Japanese)【図16】
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(In Japanese)【図19】
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(In Japanese)【図20】
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(In Japanese)【図22】
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(In Japanese)【図25】
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(In Japanese)【図28】
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(In Japanese)【図29】
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(In Japanese)【図31】
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