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Specification :(In Japanese)国産および外国産のイネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の識別法

Country (In Japanese)日本国特許庁(JP)
Gazette (In Japanese)特許公報(B2)
Patent Number P5763315
Publication number P2012-055254A
Date of registration Jun 19, 2015
Date of issue Aug 12, 2015
Date of publication of application Mar 22, 2012
Title of the invention, or title of the device (In Japanese)国産および外国産のイネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の識別法
IPC (International Patent Classification) C12Q   1/68        (2006.01)
C12N  15/09        (2006.01)
FI (File Index) C12Q 1/68 ZNAA
C12N 15/00 A
Number of claims or invention 5
Total pages 21
Application Number P2010-202984
Date of filing Sep 10, 2010
Date of request for substantive examination Jul 24, 2013
Patentee, or owner of utility model right (In Japanese)【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Inventor, or creator of device (In Japanese)【氏名】岸根 雅宏
【氏名】奥西 智哉
Representative (In Japanese)【識別番号】100089118、【弁理士】、【氏名又は名称】酒井 宏明
Examiner (In Japanese)【審査官】山本 晋也
Document or reference (In Japanese)米国特許出願公開第2007/0294788(US,A1)
特開2007-190032(JP,A)
特開2006-042608(JP,A)
特開2004-248635(JP,A)
特開平06-277063(JP,A)
特開2004-121032(JP,A)
国際公開第2003/040363(WO,A1)
特開2009-254239(JP,A)
特開2008-131943(JP,A)
中国特許出願公開第102031253(CN,A)
中国特許出願公開第102251054(CN,A)
石谷 他 編集,米の科学,1998年 9月10日,p.6-8
Monden et al,DNA Research,2009年,Vol. 16,p. 131-140
イネのトランスポゾン,2003年 1月24日,URL,http://tech.braina.com/2003/0124/bio_20030124_001____.html
Nakazaki et al,Nature,2003年 1月 9日,Vol. 421,p. 170-172
Field of search C12N
C12Q
G01N
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamIII)
GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq
Thomson Innovation
Food Science and Technology Abstracts(FSTA)(ProQuest Dialog)
Foodline Science(ProQuest Dialog)
Scope of claims (In Japanese)【請求項1】
ジャポニカ種米およびインディカ種米のイネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の識別法であって、
被験ゲノムDNAにおいて、mPing挿入部位の遺伝的多型に基づいて、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品がジャポニカ種米またはインディカ種米であるかを識別することを含み、
mPing挿入部位が、第6染色体中に見出される3番目のmPing挿入部位、または/および第12染色体中に見出される1番目のmPing挿入部位である、識別法。
【請求項2】
前記mPing挿入部位の遺伝的多型として、前記mPing挿入部位のいずれも確認された場合に、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品が、ジャポニカ種米のものであると識別する、請求項1記載の識別法。
【請求項3】
前記mPing挿入部位の遺伝的多型として、前記mPing挿入部位のいずれも確認されなかった場合に、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品が、インディカ種米のものであると識別する、請求項1記載の識別法。
【請求項4】
以下からなる群より選ばれるプライマーの組合せを含む、イネにおけるmPing挿入部位の有無を検出し得る2以上のプライマーを用いる、請求項1~3のいずれか一項記載の識別法
1a)配列番号1に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
1b)配列番号1に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
1c)配列番号1に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
1d)配列番号1に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
1e)配列番号1に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
1f)配列番号1に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
2a)配列番号2に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
2b)配列番号2に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
2c)配列番号2に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
2d)配列番号2に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
2e)配列番号2に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
2f)配列番号2に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ
であり、
ここで、前記少なくとも一部の塩基配列が、15個以上のヌクレオチド残基からなり、
前記その均等な塩基配列が、15個以上のヌクレオチド残基からなり、かつイネの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する
【請求項5】
請求項4記載の1a)~1f)のいずれか1つのプライマーの組合せ、および請求項4記載の2a)~2f)のいずれか1つのプライマーの組合せを含む、2以上のプライマーのセットを用いる、請求項4記載の識別法
Detailed description of the invention (In Japanese)【技術分野】
【0001】
本発明は、国産および外国産のイネまたはそれに由来する組織(例、国産米・外国産米)、あるいはそれらの加工品の識別法などに関する。
【背景技術】
【0002】
2008年、本来非食用として売却された事故米穀が、食用として転売される「事故米不正転売事件」が発覚した。この事件では、主にミニマムアクセス米として輸入された外国産米が事故米穀として販売されていた。したがって、米を加工原料とする食品関連企業では、品質保証のため、外国産米を簡易に検出する技術を必要としている。また、事件を受けて、米の原産地(国)表示を義務化する米トレーサビリティ制度が導入されることとなり、それを実効力あるものとするためにも国産米・外国産米の識別技術が必要である。
【0003】
従来の技術では、RAPD-STS法(特許文献1、2)、SNP法(特許文献3、4)、SSR法(特許文献5~7)などを利用して米の品種を識別することを目的に技術開発が行われてきた。
【先行技術文献】
【0004】

【特許文献1】特開2001-095589
【特許文献2】特開2005-073655
【特許文献3】特開2004-248635
【特許文献4】特開2009-219498
【特許文献5】特開平10-057073
【特許文献6】特開2004-065251
【特許文献7】特開2007-037468
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、従来は、あらかじめ基準となる品種群の分析データの蓄積を行い、検査対象の結果をそのデータベースに照合することによって品種が識別されていた。そのため、外国産米を識別するには、基準となる品種を数多く収集・分析することが必要であるが、そもそも外国産米では品種の概念が曖昧な場合も多く、また我が国に輸入される米を網羅することは困難である。さらに、従来技術は分析対象が単一の品種である場合には効果を発揮するが、2品種以上が混在した試料や、わずかに外国産米が混入した試料では、分析結果が複雑になり識別が困難となる。
【0006】
したがって、本発明の目的は、国産米と外国産米の品種を簡便に識別する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、鋭意検討した結果、国産米と外国産米の品種を高度に識別し得る、ゲノム上の2種のヌクレオチド領域(トランスポゾンの一種であるmPingの挿入部位)を同定することに成功した。また、かかる領域を同定することにより、国産米と外国産米の品種を識別する方法などを開発することに成功し、本願発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち、本発明は、被験ゲノムDNAにおいて、mPing挿入部位の遺伝的多型に基づいて、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品が国産または外国産であるかを識別する、国産および外国産のイネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の識別法、ならびにイネにおけるmPing挿入部位の有無を検出し得る2以上のプライマーおよびそのセットを提供する。
【発明の効果】
【0009】
本発明では、国産のイネに特異的なmPing挿入部位の解析によって、国産品種と外国産品種を大きく大別するための手法を提供する。従来技術のように品種自体を同定するのではないため、品種データの蓄積は必要でない。また、たった2種のDNAマーカーの簡便な分析により、国産品種と外国産品種とを高度に識別できる。さらに、複数品種の混合サンプルの場合にも、外国産米の混入を容易に検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】図1は、国産のイネに特異的である、第6染色体中に見出される3番目のmPing挿入部位(6-3)を検出するためのプライマー対のタイプを示す図である。
【図2】図2は、国産のイネに特異的である、第12染色体中に見出される1番目のmPing挿入部位(12-1)を検出するためのプライマー対のタイプを示す図である。
【図3】図3は、国産のイネの一品種である日本晴のmPing挿入部位(6-3)周辺(第6染色体:30096255~30101254)の塩基配列(5000bp)を示す図である。ボックス部分は、mPing挿入部位(6-3)を示し、下線を付記した部分は、実施例で用いられたプライマーの位置を示す(図4も同様)。なお、染色体上の位置は、MSU Rice Genome Annotation Release 6.1(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)に従っている(図4も同様)。
【図4】図4は、国産のイネの一品種である日本晴のmPing挿入部位(12-1)周辺(第12染色体:836319~841318)の塩基配列(5000bp)を示す図である。
【図5】図5は、2種のマーカーを用いた日本(16種)、タイ(18種)およびベトナム(13種)のイネの品種の分析結果を示す図である。日本のイネの品種:左から順に(1)日本晴;(2)コシヒカリ;(3)ひとめぼれ;(4)ヒノヒカリ;(5)あきたこまち;(6)はえぬき;(7)キヌヒカリ;(8)きらら397;(9)ななつぼし;(10)つがるロマン;(11)ほしのゆめ;(12)まっしぐら;(13)あさひの夢;(14)あいちのかおり;(15)夢つくし;(16)こしいぶき。タイのイネの品種:左から順に(1’)RD6;(2’)RD21;(3’)Khao Tah Hang 17;(4’)Jek Chuey;(5’)Sow Hai;、(6’)Khao Dawk Mali 105;(7’)CNT1;(8’)RD8;(9’)Lenang Pra Tew 123;(10’)Chainat 1;(11’)Suphanburi 1;(12’)Suphanburi 2;(13’)名称不明の品種(1);(14’)名称不明の品種(2);(15’)名称不明の品種(3);(16’)名称不明の品種(4);(17’)名称不明の品種(5);(18’)TH。ベトナムのイネの品種:左から順に(1’’)P4;(2’’)Tam Ap Be;(3’’)Bac Huong;(4’’)Tam Xoan;(5’’)IR64;、(6’’)Ai64;(7’’)X21;(8’’)Q5;(9’’)C70;(10’’)Khang Dan;(11’’)XI23;(12’’)108AV;(13’’)IR352。1品種の例外(*)を除いて、日本品種では、サイズの大きなDNA(L)の増幅が認められ、タイ・ベトナム品種では、サイズの小さなDNA(S)の増幅が認められる。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明は、国産および外国産のイネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品(以下、必要に応じて、「イネ等」と省略する)の識別法を提供する。

【0012】
一実施形態では、本発明は、国産および外国産のイネの識別法に関する。本発明において、「イネ」とは、成長した植物体および未熟な植物体(例、苗)のみならず、枯れた植物体である稲わらをも意味するものとする。イネとしては、国産のイネおよび外国産のイネが挙げられる。

【0013】
国産のイネは、ジャポニカ種のイネであり得る。このような国産のイネの品種としては、例えば、てんたかく、てんこもり、とがおとめ、にこまる、あいちのかおり、なつしずか、はなの舞い、アケボノ、朝日、吉備の華、ちゅらひかり、農林48号、あきろまん、中生新千本、ホウレイ、広島21号(こいもみじ)、あきたこまち、でわひかり、たかねみのり、めんこいな、淡雪こまち、なすひかり、ゴロピカリ、さわぴかり、コシヒカリ、ハナエチゼン、フクヒカリ、イクヒカリ、あきさかり、キヌヒカリ、どんとこい、きぬむすめ、晴るる、せとのにじ、ヒノヒカリ、まいひかり、さきひかり、きらり宮崎、夢しずく、天使の詩、さがびより、たんぼの夢、レイホウ、日本晴、秋の詩、レーク65、ゆめおうみ、吟おうみ、祝、雄山錦、誉富士、ひだほまれ、雄町、八反錦1号、八反(八反35号)、千本錦、こいおまち、秋田酒こまち、とちぎ酒14、舞風、山田錦、兵庫夢錦、兵庫北錦、神の舞、佐香錦、改良雄町、西都の雫、はなかぐら、さがの華、玉栄、吟吹雪、総の舞、とみちから、らいちょうもち、新大正糯、ひみこもち、するがもち、峰の雪もち、たかやまもち、ヤシロモチ 、マンゲツモチ、たつこもち、きぬのはだ、モチミノリ、タンチョウモチ、カグラモチ、はりまもち、ヤマフクモチ、ミコトモチ、ミヤタマモチ、ヒヨクモチ、ヒデコモチ、滋賀羽二重糯、ハクトモチ、鈴原糯、ヒメノモチ、ユメヒカリ、おおいた11、ちば28号(ふさこがね)、ふさおとめ、ヤマヒカリ、おまちかね、ヤマホウシ、いわてっこ、どんぴしゃり、かけはし、愛のゆめ、松山三井、森のくまさん、くまさんの力、あきまさり、あきげしき、いただき、ゆめひたち、オオセト、さぬきよいまい、あいちのかおりSBL、あさひの夢、大地の風、ミネアサヒ、チヨニシキ、祭り晴、みねはるか、つや姫、はえぬき、里のゆき、秋晴、きらりん、天竜乙女、ナツヒカリ、南国そだち、黄金錦、さわかおり、アキツホ、土佐錦、はなさつま、あきほなみ、彩南月、夢はやと、みえのゆめ、みえのえみ、ひとめぼれ、ササニシキ、まなむすめ、トヨニシキ、たきたて、やまのしずく、ゆきむすび、ななつぼし、きらら397、ほしのゆめ、ふっくりんこ、ゆめぴりか、大地の星、あやひめ、ほしまる、ゆきひかり、ふくみらい、まいひめ、つがるロマン、まっしぐら、むつほまれ、ねばりゆき、どまんなか、アキヒカリ、ミルキークイーン、おぼろづき、あきさやか、露葉風、吟ぎんが、ぎんおとめ、ひたち錦、若水、夢山水、出羽燦々、出羽の里、美山錦、ひとごこち、金紋錦、しらかば錦、もち美人、カグヤモチ、ココノエモチ、恵糯、喜寿糯、こゆきもち、でわのもち、ユキミモチ、アネコモチ、もちひかり、モリモリモチ、さつま雪もち、さとじまん、ミルキープリンセス、萌えみのり、スノーパール、夢つくし、つくしろまん、元気つくし、つやおとめ、夢一献、ハツシモ岐阜SL、ハツシモ、こしいぶき、ゆきん子舞、ゆきの精、越路早生、トドロキワセ、なごりゆき、朝の光、彩のかがやき、彩のほほえみ、彩のみのり、能登ひかり、ほほほの穂、ゆめみづほ、吟の夢、神の穂、蔵の華、吟風、彗星、夢の香、華吹雪、華想い、五百万石、越淡麗、さけ武蔵、石川酒52号、みやこがねもち、はくちょうもち、風の子もち、しろくまもち、式部糯、朝紫、夕やけもち、紫こぼし、わたぼうし、こがねもち、白山もち、新羽二重糯が挙げられる。なお、これらの240品種は、日本の米の流通量の99.4%を占める。国産のイネとしては、上記以外にも、国産のイネに挿入されているmPing挿入部位を検出できるものが存在し得る。

【0014】
外国産のイネは、インディカ種のイネであり得る。このような外国産のイネとしては、例えば、東南アジア産のイネが挙げられる。東南アジア産のイネとしては、例えば、タイ産のイネ、およびベトナム産のイネが挙げられる。タイ産のイネの品種としては、例えば、RD6、RD21、Khao Tah Hang 17、Jek Chuey、Sow Hai、Khao Dawk Mali 105、CNT1、RD8、Lenang Pra Tew 123、Chainat 1、Suphanburi 1、Suphanburi 2、THが挙げられる。ベトナム産のイネの品種としては、例えば、P4、Tam Ap Be、Bac Huong、Tam Xoan、IR64、Ai64、X21、Q5、C70、Khang Dan、XI23、108AV、IR352が挙げられる。なお、外国産のイネとしては、上記以外にも、国産のイネに挿入されているmPing挿入部位を検出できないものが存在し得る。

【0015】
別の実施形態では、本発明は、国産および外国産のイネに由来する組織の識別法に関する。本発明において、「イネに由来する組織」とは、イネの植物体の一部を意味するものとし、例えば、茎、葉、根部、米(即ち、イネ種子)が挙げられる。米は、玄米または精米のいずれであってもよい。米としてはまた、うるち米、もち米、醸造用米が挙げられる。うるち米、もち米、醸造用米の品種は、表2~4の記載より明らかである。

【0016】
さらに別の実施形態では、本発明は、国産および外国産のイネまたはそれに由来する組織の加工品の識別法に関する。本発明において、イネまたはそれに由来する組織の「加工品」とは、イネまたはそれに由来する組織(例、米)を含む加工物であって、本発明により使用され得るイネDNAを抽出できるものである限り特に限定されない。このような加工品としては、例えば、米の加工品(例、炊飯米、加工米飯、みそ、米菓、米穀粉、包装もち、ビーフン、玄米茶、米粉パン、米粉麺、日本酒、ビール)、稲わらの加工品(例、飼料、敷料、床敷、民芸品)が挙げられる。本方法では、加工品自体が、国産または外国産のイネまたはそれに由来する組織から作成されているか否か、あるいは加工品に含まれる材料または成分が、国産または外国産のイネまたはそれに由来する組織に由来するか否かが識別され得る。

【0017】
本発明の識別法は、被験ゲノムDNAにおいて、国産のイネに特異的なmPing挿入部位の遺伝的多型に基づいて、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品が国産または外国産であるかを識別することを含む。

【0018】
本発明の識別法で利用される、国産のイネに特異的なmPing挿入部位は、国産のイネで高度に保存されている、第6染色体中に見出される3番目のmPing挿入部位(6-3)、および第12染色体中に見出される1番目のmPing挿入部位(12-1)である。mPingは、数あるトランスポゾンの一種であり、国産米の一品種である日本晴のゲノム配列中には、全50箇所のmPing挿入部位が見出されている(表1を参照)。

【0019】
本発明において、「第6染色体中に見出される3番目のmPing挿入部位」とは、日本米の一品種である日本晴を基準とした場合に、第6染色体の5’末端から数えて3番目に見出されるmPing挿入部位をいう。より具体的には、日本晴では、第6染色体中に見出される3番目のmPing挿入部位は、MSU Rice Genome Annotation Release 6.1(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)に従うと、第6染色体の30098540~30098969番目のヌクレオチド残基に対応する。第6染色体中に見出される3番目のmPing挿入部位は、表6に記載されるように、236品種の国産米(表2~4に記載される240品種のうち、雄山錦、ひだほまれ、ヒメノモチ、白山もちの4品種を除く)で確認されている。第6染色体中に見出される3番目のmPing挿入部位は、本明細書中において、「6-3」(または単に「6」)と略記される場合がある。

【0020】
本発明において、「第12染色体中に見出される1番目のmPing挿入部位」とは、日本米の一品種である日本晴を基準とした場合に、第12染色体の5’末端から数えて1番目に見出されるmPing挿入部位をいう。より具体的には、日本晴では、第12染色体中に見出される1番目のmPing挿入部位は、MSU Rice Genome Annotation Release 6.1(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)に従うと、第12染色体の838604~839033番目のヌクレオチド残基に対応する。第12染色体中に見出される1番目のmPing挿入部位は、表6に記載されるように、231品種の国産米(表2~4に記載される240品種のうち、あきろまん、中生新千本、ヤシロモチ、ハクトモチ、土佐錦、喜寿糯、さつま雪もち、なごりゆき、彗星の9品種を除く)で確認されている。第12染色体中に見出される1番目のmPing挿入部位は、本明細書中において、「12-1」(または単に「12」)と略記される場合がある。

【0021】
本発明の識別法で利用される、国産のイネに特異的なmPing挿入部位は、6-3および12-1のいずれか1つでもよいが、6-3および12-1の2つでもよい。

【0022】
本発明の識別法では、上述したmPing挿入部位の遺伝的多型として、上述したmPing挿入部位が確認された場合に、イネ等が国産のものである(または外国産のものではない)と識別され得る。具体的には、上述したmPing挿入部位として、6-3の存在が確認された場合、または12-1の存在が確認された場合に、イネ等が国産のものであると識別してもよいが、好ましくは、6-3および12-1の双方の存在が確認された場合に、イネ等が国産のものであると識別される。

【0023】
一方、上述したmPing挿入部位の遺伝的多型として、上述したmPing挿入部位が確認されなかった場合に、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品が、外国産のものである(または国産のものではない)と識別され得る。具体的には、上述したmPing挿入部位として、6-3の存在が確認されなかった場合、または12-1の存在が確認されなかった場合に、イネ等が外国産のものであると識別してもよいが、好ましくは、6-3および12-1の双方の存在が確認されなかった場合に、イネ等が外国産のものであると識別される。

【0024】
具体的には、本発明の識別法は、被験ゲノムDNAにおいて、国産のイネに特異的なmPing挿入部位の有無を検出することにより、国産および外国産のイネ等を識別することによって達成される。被験ゲノムDNAは、イネ等(例、米)から自体公知の方法によって調製できる。具体的には、国産および外国産のイネ等(例、国産米および外国産米)の識別は、a)イネに由来する組織(例、米)あるいはイネまたはイネに由来する組織の加工品からイネのゲノムDNAを抽出し、次いで、b)DNA解析法により、国産のイネに特異的なmPing挿入部位の有無を検出し、次いで、c)国産のイネに特異的なmPing挿入部位の有無に基づいて、イネ等が国産のものであるか、または外国産のものであるかを識別することにより、行われる。識別はまた、標品を併用することにより、被験物および標品との間において、DNA解析法による国産のイネに特異的なmPing挿入部位の検出の有無または/および検出プロフィールの概要を比較することにより行なわれてもよい。標品は、任意のイネの品種であり特に限定されないが、例えば、基準品種である日本晴、ならびに被験物と同じ品種であることが疑われる特定の品種が挙げられる。本発明の識別法は、例えば、国産米の検出、外国産米の混入の検出などに有用である。

【0025】
本発明の識別法では、イネ等の識別において、遺伝子増幅法(例、PCR、LAMP、ICAN)等のDNA解析法が用いられる。本発明はまた、このような用途に使用できる、国産のイネに特異的なmPing挿入部位の有無を検出し得る2以上のプライマーを提供する。なお、本発明において、「2以上のプライマー」とは、特定の1つの領域を検出するための2以上のプライマーの組合せを意味する。アッセイに必要なプライマーの数は、用いられる遺伝子増幅法の種類によっても異なり得るので、プライマー数は適宜調整できる。以下、国産のイネに特異的なmPing挿入部位を増幅するための2以上のプライマーの代表例について、詳述する。

【0026】
1)第6染色体中に見出される3番目のmPing挿入部位(6-3)
6-3のmPing挿入部位は、配列番号1に示される塩基配列(6-3のmPing挿入部位周辺の塩基配列)において、2286~2715番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図3)。したがって、6-3のmPing挿入部位を検出するための2以上のプライマーとして、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せ(トランスポゾンの有無に応じてサイズの異なる増幅産物を得ることにより、トランスポゾンの有無を検出し得るプライマーの組合せ)、ならびに本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)、または本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せ(増幅の有無によりmPing挿入部位の有無を検出し得るプライマーの組合せ)を用いることができる。このような2以上のプライマーとしては、例えば、以下が挙げられる(例、図1を参照):
1a)配列番号1に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
1b)配列番号1に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
1c)配列番号1に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
1d)配列番号1に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
1e)配列番号1に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
1f)配列番号1に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号1に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ。

【0027】
2)第12染色体中に見出される1番目のmPing挿入部位(12-1)
12-1のmPing挿入部位は、配列番号2に示される塩基配列(12-1のmPing挿入部位周辺の塩基配列)において、2286~2715番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する(図4)。したがって、12-1のmPing挿入部位を検出するための2以上のプライマーとして、本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せ(トランスポゾンの有無に応じてサイズの異なる増幅産物を得ることにより、トランスポゾンの有無を検出し得るプライマーの組合せ)、ならびに本領域の上流部位(センス鎖またはアンチセンス鎖)、または本領域の下流部位(アンチセンス鎖またはセンス鎖)に対応する第1のプライマー、および本領域(センス鎖またはアンチセンス鎖)に対応する第2のプライマーの組合せ(増幅の有無によりmPing挿入部位の有無を検出し得るプライマーの組合せ)を用いることができる。このような2以上のプライマーとしては、例えば、以下が挙げられる(例、図2を参照):
2a)配列番号2に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
2b)配列番号2に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
2c)配列番号2に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
2d)配列番号2に示される塩基配列における1~2285番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ;
2e)配列番号2に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第2のプライマーの組合せ;
2f)配列番号2に示される塩基配列における2286~2715番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第1のプライマー、および配列番号2に示される塩基配列における2716~5000番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第2のプライマーの組合せ。

【0028】
上述した「均等な塩基配列」は、イネの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列であり得る。したがって、所定の塩基配列(例、配列番号Xに示される塩基配列においてY~Z番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列)に均等な塩基配列は、所定の塩基配列において数個(例えば1~10個、好ましくは1~5個、より好ましくは1、2または3個)の塩基の修飾(例、置換、欠失、挿入、付加)を含む塩基配列であり得る。このような均等な塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかであり、イネの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、あるいはイネの品種における上記6-3および12-1の領域周辺の塩基配列を解読することにより、決定できる。

【0029】
プライマーを構成するヌクレオチド残基(標的部位にアニーリングする相補部分のヌクレオチド残基)の数は、プライマーが標的部位にアニーリングして、目的産物を特異的に増幅できる限り特に限定されず、例えば、15個以上、16個以上、17個以上、18個以上、または20個以上であってもよい。また、プライマーを構成するヌクレオチド残基の数は、例えば、50個以下、40個以下、または30個以下であってもよい。

【0030】
プライマーは、増幅産物の検出のため、蛍光物質で標識されていてもよい。このような蛍光物質としては、例えば、6-FAM、VIC、NED、PETが挙げられる。

【0031】
増幅産物のサイズは、測定機器において、測定対象であるmPing挿入部位を検出できるようなサイズである限り特に限定されない。例えば、増幅産物の下限サイズ(例、mPing挿入部位を検出可能な増幅産物のサイズの下限値)は、例えば、50bp以上、100bp以上、150bp以上、200bp以上であってもよい。増幅産物の上限サイズ(例、mPing挿入部位を検出可能な増幅産物のサイズの上限値)は、特に限定されないが、アッセイの簡便化等(例、PCR等による増幅時間の短縮、ゲル電気泳動時間の短縮)の観点から、例えば、5000bp以下、4500bp以下、4000bp以下、3500bp以下、3000bp以下、2500bp以下、2000bp以下、1500bp以下、1000bp以下、900bp以下、800bp以下、700bp、600bp以下、500bp以下であってもよい。したがって、2以上のプライマーは、このような長さの増幅産物が増幅されるように、このような長さで離れている2つの領域に対して設計されてもよい。

【0032】
上述したように、本発明の識別法は、イネ等の識別において、遺伝子増幅法等のDNA解析法を利用することにより達成できるが、本発明はまた、このような用途に使用できる、上記1a)~1f)のいずれか1つのプライマーの組合せ、および上記の2a)~2f)のいずれか1つのプライマーの組合せを含む、2以上のプライマーのセット(例、4以上のプライマーの組合せ)を提供する。本発明の知見なしに、上述した2以上のプライマーを2つ組み合せる動機付けは、従来存在しない。本発明の試薬に含まれる2以上のプライマーは、異なる蛍光色を発する別々の蛍光物質により標識されたものであってもよい。

【0033】
以下に、本発明を詳細に説明するが、本実施例により本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【0034】
実施例1:米を用いた国産米のゲノムDNAにおけるトランスポゾンmPingの解析
mPingは、MITE(miniature inverted repeat transposable element)と呼ばれるクラスのトランスポゾンの1種であり、MITEとして初めてイネにおいて転移活性を有していることが報告された。mPingは、日本晴とコシヒカリといった近代に育種された品種間でも挿入多型が存在することが報告されていることから、mPingの挿入多型が近縁な国産米の品種間の識別に利用可能であると推測された。そこで、国産米の一品種である日本晴における全50箇所のmPing挿入部位が、他の国産米(全240品種:表2~4を参照)でも保存されているか否かについて網羅的に検討した。なお、表2~4に記載される240品種の国産米は全てジャポニカ種であり、これらの240品種は、日本の米の流通量の99.4%を占める。
【実施例】
【0035】
【表1】
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【実施例】
【0036】
【表2】
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【実施例】
【0037】
【表3】
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【実施例】
【0038】
【表4】
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【実施例】
【0039】
具体的には、国産米におけるmPing挿入部位の保存性の解析は、日本晴におけるmPing挿入部位の上流部位および下流部位に対するプライマー対を設計し、このプライマー対を用いて定法によりPCRを行い、得られた増幅産物のサイズに基づいて行った。PCRにおけるテンプレートとしては、米から定法により抽出したゲノムDNAを用いた。得られた増幅産物のサイズが大きい場合(L)は、解析領域内にmPing挿入部位が存在することを示す。一方、得られた増幅産物のサイズが小さい場合(S)は、解析領域内にmPing挿入部位が存在しないことを示す。結果を、以下の表5に示す。
【実施例】
【0040】
【表5】
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【実施例】
【0041】
その結果、国産米の品種の識別のためのDNAマーカーとしてmPing挿入部位が使用できるかどうかを調べるという当初の目的とは異なっていたが、6-3および12-1のmPing挿入部位が、他のmPing挿入部位に比し、国産米の品種間で極めて高度に保存されていることが見出された(表5、および図5における「日本」のレーンを参照)。6-3および12-1のmPing挿入部位について、国産米の240品種の分析結果の詳細を、表6に示す。また、6-3および12-1のmPing挿入部位の有無の確認のために用いたプライマー対の詳細を、以下の表7に示す。
【実施例】
【0042】
【表6】
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【実施例】
【0043】
【表7】
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【実施例】
【0044】
実施例2:米を用いた外国産米のゲノムDNAにおけるmPing挿入部位の有無の解析
次いで、国産米の品種間で極めて高度に保存されている6-3および12-1のmPing挿入部位が、外国産米(全31品種:18品種のタイ米+13品種のベトナム米:表8を参照)でも保存されているかどうかについて検討した。なお、表8に記載される31品種の外国産米は全てインディカ種である。
【実施例】
【0045】
【表8】
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【実施例】
【0046】
具体的には、外国産米におけるmPing挿入部位の保存性の解析は、実施例1と同様に、日本晴におけるmPing挿入部位の上流部位および下流部位に対するプライマー対を設計し、このプライマー対を用いて定法によりPCRを行い、得られた増幅産物のサイズに基づいて行った(用いたプライマー対の詳細は、表7を参照)。PCRにおけるテンプレートとしては、米から定法により抽出したゲノムDNAを用いた。結果を、以下の表9に示す。
【実施例】
【0047】
【表9】
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【実施例】
【0048】
その結果、外国産米では、6-3および12-1のmPing挿入部位が、一例(タイ米の一品種についての12-1)を除き、保存されていなかった(表9、および図5における「タイ」および「ベトナム」のレーンを参照)。
以上より、国産米の品種間で極めて高度に保存されている6-3および12-1のmPing挿入部位が、国産米・外国産米の品種の識別のためのDNAマーカーとして優れることが示された。
Drawing
(In Japanese)【図1】
0
(In Japanese)【図2】
1
(In Japanese)【図3】
2
(In Japanese)【図4】
3
(In Japanese)【図5】
4