明細書 :アプタマー及び抗体検出方法
| 発行国 | 日本国特許庁(JP) | ||||||||||||||
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| 公報種別 | 特許公報(B2) | ||||||||||||||
| 特許番号 | 特許第6793917号 (P6793917) | ||||||||||||||
| 公開番号 | 特開2018-027024 (P2018-027024A) | ||||||||||||||
| 登録日 | 令和2年11月13日(2020.11.13) | ||||||||||||||
| 発行日 | 令和2年12月2日(2020.12.2) | ||||||||||||||
| 公開日 | 平成30年2月22日(2018.2.22) | ||||||||||||||
| 発明の名称または考案の名称 | アプタマー及び抗体検出方法 | ||||||||||||||
| 国際特許分類 | C12N 15/115 (2010.01) C12Q 1/68 (2018.01) G01N 33/53 (2006.01) |
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| ＦＩ | C12N 15/115 ZNAZ C12Q 1/68 G01N 33/53 N |
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| 請求項の数または発明の数 | 16 | ||||||||||||||
| 全頁数 | 24 | ||||||||||||||
| 出願番号 | 特願2016-159227 (P2016-159227) | ||||||||||||||
| 出願日 | 平成28年8月15日(2016.8.15) | ||||||||||||||
| 審査請求日 | 令和元年8月8日(2019.8.8) | ||||||||||||||
| 特許権者または実用新案権者 | 【識別番号】504132881 【氏名又は名称】国立大学法人東京農工大学 【識別番号】507219686 【氏名又は名称】静岡県公立大学法人 |
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| 発明者または考案者 | 【氏名】池袋 一典 【氏名】齊藤 太郎 【氏名】轟木 堅一郎 【氏名】中野 達基 【氏名】豊岡 利正 |
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| 個別代理人の代理人 | 【識別番号】100114890、【弁理士】、【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト 【識別番号】100116403、【弁理士】、【氏名又は名称】前川 純一 【識別番号】100135633、【弁理士】、【氏名又は名称】二宮 浩康 【識別番号】100162880、【弁理士】、【氏名又は名称】上島 類 【識別番号】100118072、【弁理士】、【氏名又は名称】醍醐 美知子 |
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| 審査官 | 【審査官】山本 匡子 | ||||||||||||||
| 参考文献・文献 | 国際公開第２０１７／０９４７３３（ＷＯ，Ａ１） 特開２０１０－２２７０４８（ＪＰ，Ａ） 特開２０１０－０５７４５１（ＪＰ，Ａ） 国際公開第２０１１／０２１３０８（ＷＯ，Ａ１） 国際公開第２０１４／１０３７３８（ＷＯ，Ａ１） 特開２００８－２３７０４２（ＪＰ，Ａ） 特開２０１１－０９２１３８（ＪＰ，Ａ） 特表２０１４－５０９８４９（ＪＰ，Ａ） Saito, T., et al.，Detection of anti-VEGF antibody bevacizumab using DNA aptamer，第42回国際核酸化学シンポジウム，２０１５年，42，246-247，P063 |
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| 調査した分野 | Ｃ１２Ｎ １５／００－９０ Ｃ１２Ｑ １／００－３／００ Ｇ０１Ｎ ３３／５３ ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ） ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ） |
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| 特許請求の範囲 | 【請求項1】 下記式（Ｉ）で示されるポリヌクレオチドであって、免疫グロブリンＧ抗体分子に結合し得るアプタマー： （Ｌ１）ｘ－［（Ｐ）－（Ｌ２）ｙ］ｎ－（Ｌ３）ｚ （Ｉ） （式中、 Ｐは、以下の配列番号１～配列番号４のいずれかで示されるポリヌクレオチド配列を表し、 GCGGTTGGTGGTAGTTACGTTCGC（配列番号１） CCGGTTGGTGGTAGTTACGTTCGG（配列番号２） GGGGTTGGTGGTAGTTACGTTCCC（配列番号３） CGGGTTGGTGGTAGTTACGTTCCG（配列番号４） Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、Ｐと相互作用しないポリヌクレオチド配列からなるリンカー配列を表し、 ｎは、１以上の整数を表し、 ｘ、ｙ及びｚは、それぞれ独立に０又は１の整数を表し、ただし、ｎが２以上の場合に、複数のｙは同一であっても異なっていてもよい）。 【請求項2】 Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、３～６０ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列である請求項１記載のアプタマー。 【請求項3】 Ｌ１～Ｌ３のうち少なくとも２つのリンカー配列を含み、存在するリンカー配列が、少なくとも１つの他のリンカー配列の少なくとも一部と互いに相互作用可能なポリヌクレオチド配列からなる請求項１又は請求項２記載のアプタマー。 【請求項4】 ヌクレオチドの核酸部分が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び人工核酸からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１～請求項３のいずれか１項記載のアプタマー。 【請求項5】 抗体分子が、血管内皮増殖因子に対する抗体分子である請求項１～請求項４のいずれか１項記載のアプタマー。 【請求項6】 抗体分子が、ベバシズマブである請求項１～請求項５のいずれか１項記載のアプタマー。 【請求項7】 抗体分子が、抗体全体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディー、単鎖抗体分子、及び、ＣＤＲを含む抗体断片からなる群より選択される少なくともひ とつである請求項１～請求項６のいずれか１項記載のアプタマー。 【請求項8】 下記式（Ｉ）で示されるポリヌクレオチド： （Ｌ１）ｘ－［（Ｐ）－（Ｌ２）ｙ］ｎ－（Ｌ３）ｚ （Ｉ） （式中、 Ｐは、以下の配列番号１～配列番号４のいずれかで示されるポリヌクレオチド配列を表し、 GCGGTTGGTGGTAGTTACGTTCGC（配列番号１） CCGGTTGGTGGTAGTTACGTTCGG（配列番号２） GGGGTTGGTGGTAGTTACGTTCCC（配列番号３） CGGGTTGGTGGTAGTTACGTTCCG（配列番号４） Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、Ｐと相互作用しないポリヌクレオチド配列からなるリンカー配列を表し、 ｎは、１以上の整数を表し、 ｘ、ｙ及びｚは、それぞれ独立に０又は１の整数を表し、ただし、ｎが２以上の場合に、複数のｙは同一であっても異なっていてもよい）。 【請求項9】 配列番号１～配列番号１０のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなる請求項８記載のポリヌクレオチド。 【請求項10】 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリヌクレオチドである請求項８記載のポリヌクレオチド： （Ａ） 配列番号５～配列番号１０のポリヌクレオチド配列において、１個又は数個の塩基が、付加、欠失、又は置換された配列を有し、ＩｇＧ抗体分子に結合し得るポリヌクレオチド、 （Ｂ） 配列番号５～配列番号１０のポリヌクレオチド配列において、式（Ｉ）中Ｌ１～Ｌ３に相当する部分の配列が１０％以上の配列同一性を有し、ＩｇＧ抗体分子に結合し得るポリヌクレオチド。 【請求項11】 核酸部分が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び人工核酸からなる群より選択される少なくとも１つである請求項８～請求項１０のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。 【請求項12】 検査対象の免疫グロブリンＧ抗体分子を含有する可能性がある試料を準備すること、 請求項１～請求項７のいずれか１項記載のアプタマーを、準備された試料と接触させることを含む抗体検出方法。 【請求項13】 接触後の試料から、アプタマーと抗体分子との複合体の検出を行うこと、を含む請求項１２記載の検出方法。 【請求項14】 試料が、体液試料である請求項１２又は請求項１３記載の検出方法。 【請求項15】 抗体分子が、血管内皮増殖因子に対する抗体である請求項１２～請求項１４のいずれか１項記載の検出方法。 【請求項16】 抗体分子が、ベバシズマブである請求項１２～請求項１５のいずれか１項記載の検出方法。 |
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| 発明の詳細な説明 | 【技術分野】 【0001】 本発明は、免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧと称する）抗体を認識するアプタマー及びこれを用いる抗体を検出する方法に関する。 【背景技術】 【0002】 近年、抗体医薬品とその関連製品の開発が盛んになっている。抗体医薬品とは疾患関連因子に特異的に結合する抗体を用いたバイオ医薬品であり、高い薬効と低い副作用が期待されている。抗体医薬品の多くは、免疫原性の低下のために、抗原結合部位として機能する超可変領域（ＣＤＲ）のみが異種由来、残りの領域はヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）で構成されるヒト化モノクローナル抗体である。 一方、新しい医薬品の開発にはその医薬品の有効性や安全性を評価するための薬物動態試験が必須である。生体試料中の薬物の定量は臨床、非臨床においても薬物動態試験において重要な分析要素である。 【0003】 抗体医薬の薬物動態（ＰＫ）と薬力学（ＰＤ）については、主に酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、又は化学発光による免疫測定のようなリガンド結合法（Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ：ＬＢＡ）（例えば、非特許文献１～４）が汎用されている。 【0004】 一方、任意の分子と特異的に結合する核酸分子であるアプタマーが知られている。アプタマーは、モノクローナル抗体の親和性及び特異性に匹敵する高い親和性及び特異性を有して、例えばタンパク質及び小分子などの種々の標的分子を認識することができる、核酸リガンドである。アプタマー、特にＤＮＡアプタマーは、容易かつ安価に合成され、化学的に改変することができる。更に、それらは、それらが標的に結合する際に構造変化が起こるよう設計することができる。これらのアプタマーの利点を使って、特定の分子を検出する検出方法が提案されている（例えば、特許文献１）。 【先行技術文献】 【0005】 【特許文献1】特表２０１３－５３１９６９号公報 【0006】 【非特許文献1】Analytical Biochemistry, (2009) vol.391, pp.114-120 【非特許文献2】Journal of Clinical Oncology, (2008) vol.26, pp.399-405 【非特許文献3】American Journal of Ophthalmology,(2008) vol.146, pp.508～512 【非特許文献4】Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, (2009) vol.50, pp.861～866 【発明の概要】 【発明が解決しようとする課題】 【0007】 ヒトの血清などの生体試料中には、多種かつ多量のヒトＩｇＧが含まれている。また複数の抗体医薬が存在する試料中で特定のイディオタイプの抗体を検出することが求められる場合もある。 特定のイディオタイプの抗体を識別して、効率よく検出可能なツールと、これを用いた検出方法に対する要請がある。 【課題を解決するための手段】 【0008】 本発明には、以下の態様が含まれる。 ［１］ 下記式（Ｉ）で示されるポリヌクレオチドであって、免疫グロブリンＧ抗体分子に結合し得るアプタマー： （Ｌ１）ｘ－［（Ｐ）－（Ｌ２）ｙ］ｎ－（Ｌ３）ｚ （Ｉ） （式中、 Ｐは、以下の配列番号１～配列番号４のいずれかで示されるポリヌクレオチド配列を表し、 GCGGTTGGTGGTAGTTACGTTCGC（配列番号１） CCGGTTGGTGGTAGTTACGTTCGG（配列番号２） GGGGTTGGTGGTAGTTACGTTCCC（配列番号３） CGGGTTGGTGGTAGTTACGTTCCG（配列番号４） Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、Ｐと相互作用しないポリヌクレオチド配列からなるリンカー配列を表し、 ｎは、１以上の整数を表し、 ｘ、ｙ及びｚは、それぞれ独立に０又は１の整数を表し、ただし、ｎが２以上の場合、複数のｙは同一であっても異なっていてもよい）。 ［２］ Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、３～６０ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列である［１］に記載のアプタマー。 ［３］ Ｌ１～Ｌ３のうち少なくとも２つのリンカー配列を含み、存在するリンカー配列が、少なくとも１つの他のリンカー配列の少なくとも一部と互いに相互作用可能なポリヌクレオチド配列からなる［１］又は［２］に記載のアプタマー。 ［４］ ヌクレオチドの核酸部分が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び人工核酸からなる群より選択される少なくとも１つである［１］～［３］のいずれかに記載のアプタマー。 ［５］ 抗体分子が、血管内皮増殖因子に対する抗体分子である［１］～［４］のいずれか１に記載のアプタマー。 ［６］ 抗体分子が、ベバシズマブである［１］～［５］のいずれか１に記載のアプタマー。 ［７］ 抗体分子が、抗体全体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディー、単鎖抗体分子、及び、ＣＤＲを含む抗体断片からなる群より選択される少なくともひとつである［１］～［６］のいずれか１に記載のアプタマー。 ［８］ 下記式（Ｉ）で示されるポリヌクレオチド： （Ｌ１）ｘ－［（Ｐ）－（Ｌ２）ｙ］ｎ－（Ｌ３）ｚ （Ｉ） （式中、 Ｐは、以下の配列番号１～配列番号４のいずれかで示されるポリヌクレオチド配列を表し、 GCGGTTGGTGGTAGTTACGTTCGC（配列番号１） CCGGTTGGTGGTAGTTACGTTCGG（配列番号２） GGGGTTGGTGGTAGTTACGTTCCC（配列番号３） CGGGTTGGTGGTAGTTACGTTCCG（配列番号４） Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、Ｐと相互作用しないポリヌクレオチド配列からなるリンカー配列を表し、 ｎは、１以上の整数を表し、 ｘ、ｙ及びｚは、それぞれ独立に０又は１の整数を表し、ただし、ｎが２以上の場合、複数のｙは同一であっても異なっていてもよい）。 ［９］ 配列番号１～配列番号１０のいずれかで示されるポリヌクレオチド配列からなる［８］記載のポリヌクレオチド。 ［１０］ 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリヌクレオチドである［８］記載のポリヌクレオチド： （Ａ） 配列番号１～配列番号１０のポリヌクレオチド配列において、１個又は数個の 塩基が、付加、欠失、又は置換された配列を有し、ＩｇＧ抗体分子に結合し得るポリヌクレオチド、 （Ｂ） 配列番号５～配列番号１０の配列において、式（Ｉ）中Ｌ１～Ｌ３に相当する部分の配列が１０％以上の配列同一性を有し、ＩｇＧ抗体分子に結合し得るポリヌクレオチド。 ［１１］ 核酸部分が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び人工核酸からなる群より選択される少なくとも１つである［８］～［１０］のいずれか１に記載のポリヌクレオチド。 ［１２］ 検査対象の免疫グロブリンＧ抗体分子を含有する可能性がある試料を準備すること、［１］～［７］のいずれか１に記載のアプタマーを、準備された試料と接触させることを含む抗体検出方法。 ［１３］ 接触後の試料から、アプタマーと抗体分子との複合体の検出を行うこと、を含む［１２］に記載の検出方法。 ［１４］ 試料が、体液試料である［１２］又は［１３］に記載の検出方法。 ［１５］ 抗体分子が、血管内皮増殖因子に対する抗体である［１２］～［１４］のいずれか１に記載の検出方法。 ［１６］ 抗体分子が、ベバシズマブである［１２］～［１５］のいずれか１に記載の検出方法。 【発明の効果】 【0009】 本発明の態様によれば、特定のイディオタイプの抗体を識別して、効率よく検出可能なツールと、これを用いた検出方法が提供可能である。 【図面の簡単な説明】 【0010】 【図1】配列番号１で示されるポリヌクレオチドからなる抗体特異性アプタマーの構造の一例を示す概念図である。 【図2】配列番号５で示されるポリヌクレオチドからなる抗体特異性アプタマーの構造の一例を示す概念図である。 【図3】配列番号８で示されるポリヌクレオチドからなる抗体特異性アプタマーの構造の一例を示す概念図である。 【図4】実施例１（２）にかかるＥＬＯＮＡ法による結合評価の結果を示すグラフである。 【図5】図５（Ａ）は、ＶＥＧＦ及びトロンビンを競合タンパク質として用いた実施例１（３）にかかるＥＬＯＮＡ法による結合評価の結果を示すグラフである。図５（Ｂ）は、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた実施例１（３）にかかるＥＬＯＮＡ法による結合評価の結果を示すグラフである。 【図6】実施例２に係る血清中での結合評価の結果を示すグラフである。 【図7】実施例３に係るＡ１４＃１の特異性評価の結果を示すグラフである。 【図8】実施例４に係るＴ４４の結合評価の結果を示すグラフである。 【図9】実施例４に係るＡＴ４４の結合評価の結果を示すグラフである。 【図10】実施例５に係るＡ１４＃１の結合評価の結果を示すグラフである。 【図11】実施例５に係る１Ｇ２４Ｃの結合評価の結果を示すグラフである。 【図12】実施例５に係る２Ｃ２３Ｇの結合評価の結果を示すグラフである。 【図13】実施例５に係る１ＧＣ２ＣＧの結合評価の結果を示すグラフである。 【発明を実施するための形態】 【0011】 本実施形態にかかるアプタマーは、下記式（Ｉ）で示されるポリヌクレオチドであって、免疫グロブリンＧ抗体分子に結合し得るアプタマー： （Ｌ１）ｘ－［（Ｐ）－（Ｌ２）ｙ］ｎ－（Ｌ３）ｚ （Ｉ） （式中、 Ｐは、以下の配列番号１～配列番号４のいずれかで示されるポリヌクレオチド配列を表 し、 GCGGTTGGTGGTAGTTACGTTCGC（配列番号１） CCGGTTGGTGGTAGTTACGTTCGG（配列番号２） GGGGTTGGTGGTAGTTACGTTCCC（配列番号３） CGGGTTGGTGGTAGTTACGTTCCG（配列番号４） Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、Ｐと相互作用しないポリヌクレオチド配列からなるリンカー配列を表し、 ｎは、１以上の整数を表し、 ｘ、ｙ及びｚは、それぞれ独立に０又は１の整数を表し、ただし、ｎが２以上の場合、複数のｙは同一であっても異なっていてもよい）。 【0012】 本アプタマーは、配列番号１～配列番号４で示される特定のポリヌクレオチド配列を含む上記の式（Ｉ）で示されるポリヌクレオチドであることから、塩基の相補性に従った特定の二次構造が形成され得る。この結果、目的とする特定のＩｇＧ抗体分子を識別することができると推測される。ただし、この理論に限定されない。 本アプタマーを、本明細書では、「抗体特異性アプタマー」と称する場合がある。 【0013】 本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。 また本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。 更に本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。 更に本明細書において組成物中の各成分の割合は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を対象とする割合を意味する。 【0014】 本明細書では、２以上のヌクレオチドが連結されたヌクレオチドの連続体を、「ポリヌクレオチド鎖」又は「ポリヌクレオチド配列」と称する場合がある。本明細書では、相対するヌクレオチドが、その構成要素として含む塩基の相補性に従って互いに水素結合を形成した構造を「ヌクレオチド対」と称する場合があり、このときの相補的な２つの塩基の組み合わせを「塩基対」と称する場合がある。本明細書では、ポリヌクレオチド配列を示す場合、特に断らない限り、左側をポリヌクレオチド配列の５’末端側、右側をポリヌクレオチド配列の３’末端側を意味する。 【0015】 本明細書において「ステム部」という語とは、２つのポリヌクレオチド配列がそれぞれの構成要素として含む塩基の相補性に従って全体として二本鎖領域を形成し得る領域を意味する。よって、この語は、その領域が、完全に相補的な２つのポリヌクレオチド配列からなるという場合だけでなく、それらポリヌクレオチド配列の少なくとも一部が相補的であって、当該相補的な一部を含む所定の領域にわたって二本鎖領域が形成され得る限り、その領域が、完全には相補的でない２つのポリヌクレオチド配列からなるという場合をも含み得る。 ステム部が形成可能であることは、対象となる２つのポリヌクレオチド鎖の塩基の相補性に従って判断することができる。 【0016】 本明細書において「ループ部」とは、２つのポリヌクレオチド配列によって形成し得るステム部以外の領域を意味し、具体的には一本鎖領域を形成し得る領域を意味する。ステム部以外の一本鎖領域には、一本のポリヌクレオチド鎖が任意の形態を取ることができる。ステム部以外の一本鎖領域の具体例としては、一本のポリヌクレオチド鎖それ自身の内 部で又は二本のポリヌクレオチド鎖によって形成可能なループ部が挙げられる。一本のポリヌクレオチド鎖それ自身の内部で形成されるループ部を「ヘアピンループ」と称することがあり、二本のポリヌクレオチド鎖によって形成されるループ部を「インターナルループ」と称することがある。 ループ部が形成可能であることは、対象となる２つのポリヌクレオチド鎖の塩基配列の相補性に従って判断することができる。 【0017】 本明細書において「アプタマー」とは、主として、核酸と、塩基と、リン酸基とで構成されるポリヌクレオチドの分子を意味する。アプタマーの構成要素としての核酸には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及び人工核酸が含まれる。人工核酸は、化学的に修飾を含む核酸分子であり、架橋型核酸（Bridged Nucleic acid：ＢＮＡ。ロックド核酸（Locked nucleic acid：ＬＮＡ）とも称する）、グリセロール核酸（Glycerol nucleic acid：ＧＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（Cyclohexenyl nucleic acid：ＣＮ Ａ）、スレオース核酸（Threose nucleic acid：ＴＮＡ）などが含まれる。 【0018】 アプタマーの構成要素としてのリン酸基は、各核酸単位が連結することができれば修飾を有するものであってもよく、酸素原子に代えて硫黄原子を有することができる。このような核酸アプタマーとしては、ホスホロチオエートＯＤＮ（Phosphorothioate-ODN：ＰＳ－ＯＤＮ）を挙げることができる。 【0019】 アプタマーの構成要素として塩基には、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、イノシン（Ｉ）等の天然に存在するポリヌクレオチドに見いだされる天然型の塩基と、７－（２－チエニル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（Ｄｓ）、２－ニトロ－４－プロピニルピロール（Ｐｘ）、ＳＯＭＡｍｅｒ（登録商標）等の非天然型の塩基とを含むことができる。 【0020】 式（Ｉ）においてＰは、配列番号１～配列番号４のいずれかで示されるポリヌクレオチド配列を表す。配列番号１～配列番号４で示されるポリヌクレオチド配列は、いずれも、２４塩基長を有し、１位から３位の塩基と２２位から２４位の塩基とによる第１のステム部、８位から１０位の塩基と１６位から１８位の塩基とによる第２のステム部、４位の塩基から７位の塩基と１９位の塩基から２１位の塩基とによる第１のループ部（インターナルループ）、並びに、１１位から１５位の塩基による第２のループ部（ヘアピンループ）を備えた構造を示し得る（図１参照）。このような二次構造を有することにより、工程のＩｇＧ抗体への結合親和性が生じうると推測される。 【0021】 式（Ｉ）においてＬ１、Ｌ２及びＬ３は、Ｐと相互作用しないポリヌクレオチド配列からなるリンカー配列を表す。「Ｐと相互作用しない」とは、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３を構成するポリヌクレオチドと、Ｐ、即ち、配列番号１～配列番号４で示されるポリヌクレオチドとが、二本鎖を形成しないことを意味する。 Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の各リンカー配列は、それぞれ、Ｐと相互作用しないポリヌクレオチドであれば、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３に対応するポリヌクレオチド中に、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３が互いに相互作用可能な塩基からなる部分を含むことができる。抗体特異性アプタマーは、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３のうち少なくとも２つリンカー配列を含み、存在するリンカー配列が、少なくとも１つの他のリンカー配列の少なくとも一部と互いに相互作用可能な塩基からなる部分を含むことができる。こられに代えて、又はこれに加えて、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３に対応するポリヌクレオチドは、それ自身の内部で相互作用可能な塩基からなる領域を含むことができる。 【0022】 Ｌ１、Ｌ２及びＬ３のそれぞれのポリヌクレオチド配列は、天然型又は非天然型のランダム又は単一の塩基による配列であってよい。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３のぞれぞれのポリヌク レオチド配列は、アプタマーの設計容易性、結合親和性の観点から、それぞれ、単一の塩基、例えばチミン又はアデニンによる配列であってもよい。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の塩基長については特に制限はないが、アプタマーの安定性、結合親和性などの観点から、それぞれ、３～６０、１０～５０、又は１６～４４の範囲内から適宜選択することができる。 【0023】 式（Ｉ）中、ｘ、ｙ及びｚは、それぞれＬ１、Ｌ２及びＬ３の繰り返し単位数を表し、０又は１の整数を表す。即ち、抗体特異性アプタマーにおいて、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれあってもなくてもよい。Ｌ２が複数存在する場合、ｙは、同じであってよく異なってもよい。ｚが１のとき、ｙは０、即ち、ｌ３が存在するとき、Ｌ３に隣接するＬ２はなくてもよい。 【0024】 Ｌ１は、Ｐの３’末端側、即ち、抗体特異性アプタマーの３’末端部に位置するリンカー配列であり、アプタマーの構造安定性、又は結合親和性の観点から、３～３０、４～２８、又は６～２５の塩基長を有することができる。Ｌ１は、それ自身の内部で相互作用可能な配列であってよく、又はアプタマーの構造安定性、又は結合親和性の観点から、Ｌ２と相互作用可能な配列であってもよい。Ｌ１がＬ２と相互作用可能な配列である場合には、Pとの相補鎖配列形成の排除の観点から、３～３０、４～２８、又は６～２５個の単一 の塩基、例えばチミン又はアデニンによる配列とすることができる。 【0025】 Ｌ３は、Ｐの５’末端側、即ち、抗体特異性アプタマーの後端部に位置するリンカー配列であり、アプタマーの構造安定性、又は結合親和性の観点から、３～３０、４～２８、又は６～２５の塩基長を有することができる。Ｌ３は、それ自身の内部で相互作用可能な配列であってよく、又はアプタマーの構造安定性、又は結合親和性の観点から、Ｌ２と相互作用可能な配列であってもよい。Ｌ３がＬ２と相互作用可能な配列である場合にはPと の相補鎖配列形成の排除の観点から、３～３０、４～２８、又は６～２５の個の単一の塩基、例えばチミン又はアデニンによる配列とすることができる。 【0026】 Ｌ２は、Ｐに連結し、抗体特異性アプタマーの中央部に位置するリンカー配列であり、アプタマーの構造安定性、又は結合親和性の観点から、３～６０、１０～５０、又は１６～４４の塩基長を有することができる。Ｌ２は、アプタマーの構造安定性、又は結合親和性の観点から、Ｌ１又はＬ３と相互作用しない配列であってもよく、Ｌ１、Ｌ３、又は、Ｌ１及びＬ３の双方に相互作用可能な配列であってもよい。 【0027】 Ｌ２がＬ１又はＬ３と相互作用しない配列である場合には、例えば、３～６０、１０～５０、又は１６～４４の単一の塩基、例えばチミン又はアデニンによる配列とすることができる。 Ｌ２は、アプタマーの構造安定性又は結合親和性の観点から、Ｌ１及びＬ３の双方に相互作用可能な配列であって、１０～５０、又は１６～４４の単一の塩基、例えばチミン又はアデニンによる配列であってもよい。Ｌ２がＬ１及びＬ３の双方に相互作用可能な配列を有する場合には、抗体特異性アプタマーは、Ｌ２とＬ１との間、及びＬ２とＬ３との間で形成された複数のステム部を有することができる。 【0028】 式（Ｉ）中、ｎは１以上の整数を表す。即ち、抗体特異性アプタマーは、配列番号１～配列番号３で示されるポリヌクレオチドをいずれか１つ以上含むことができる。ｎの値は１以上であればよく、２、３、４、又はそれ以上とすることができる。ｎの上限値については特に制限はなく、例えば、２０とすることができる。 【0029】 ｎが２以上の場合、ｙは同一であっても異なってもよい。即ち、Ｐが複数存在する場合には、複数のＰの間にＬ２が存在して、かつ、抗体特異性アプタマーがＰ－Ｌ２－Ｐの構造を含むものであってもよく、複数のＰの間にＬ２がなく、かつ、抗体特異性アプタマー がＰ－Ｐの構造を含むものであってもよい。 【0030】 式（Ｉ）中、Ｐが２つ以上存在する場合には、抗体特異性アプタマーは、配列番号１～配列番号４からなる群より選択された２つ以上を有することができる。このような抗体特異性アプタマーは、配列番号１～配列番号４の多量体とも称される。抗体特異性アプタマーが、配列番号１～配列番号４の多量体であるときには、配列番号１～配列番号４のいずれか１種類の配列を複数含む多量体であってもよく、異なる種類の配列を含む複合的な多量体であってもよい。抗体特異性アプタマーが、配列番号１～配列番号４から選択された異なる種類の配列を含む多量体であるときには、配列番号１～配列番号４のうちのいずれの組み合わせであってもよく、配列の順序についても特に制限はない。 【0031】 式（Ｉ）で示される抗体特異性アプタマーの一例を示す。 【表1】 【0032】 図１は、式（Ｉ）中、ｎ＝１、ｘ＝ｙ＝ｚ＝０であって、Ｐが配列番号１で示されるポリヌクレオチドからなる抗体特異性アプタマー、１４＃１（配列番号１）を示す。 図２は、式（Ｉ）中、ｎ＝２、ｘ＝ｚ＝０、ｙ＝１及び０であって、Ｐが配列番号１で示されるポリヌクレオチドからなる抗体特異性アプタマー、Ｔ１６（配列番号５）を示す。 図３は、式（Ｉ）中、ｎ＝２、ｘ＝ｚ＝１、ｙ＝１及び０であって、Ｌ１が（Ａ）７、Ｌ２が（Ｔ）１６、Ｌ３が（Ａ）７、Ｐが配列番号１で示されるポリヌクレオチドからなる抗体特異性アプタマー、ＡＴ１６（配列番号８）を示す。 【0033】 表１中の配列番号５～配列番号７で示される配列において２５位から連続するＴの領域（Ｌ２）は、連続するＡからなる配列としてもよい。配列番号８～配列番号１０で示される配列において、３’末端側の１位から連続するＡからなる配列の領域（Ｌ１）は、Ｔからなる配列としてもよく、３２位以降の連続するＴからなる配列の領域（Ｌ２）は、Ａからなる配列としてもよく、５’末端側の連続するＡからなる配列の領域（Ｌ３）は、Ｔからなる配列としてもよい。 配列番号８～配列番号１０で示される配列において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３から選択される少なくとも１つのリンカー配列は、ＩｇＧ抗体分子に結合し得る範囲で、連続するＴの数、又は連続するＡの数を１つ以上増減したものであってもよく、０、即ち存在しなくてもよい。 配列番号８～配列番号１０で示される配列において配列番号１で示される配列の領域（Ｐ）は、配列番号２又は配列番号３で示される配列としてもよい。配列番号５～配列番号１０で示される配列において２つ存在する配列番号１で示されるポリヌクレオチドの領域（Ｐ）のうち、１つ又は全部を、配列番号２又は配列番号３で示される配列としてもよい。 【0034】 抗体特異性アプタマーの具体例には、以下のものが更に含まれる： （Ａ） 配列番号１～配列番号１０のポリヌクレオチド配列において、１個又は数個の塩基が、付加、欠失、又は置換された配列を有し、ＩｇＧ抗体分子に結合し得るポリヌクレオチド、 （３） 配列番号５～配列番号１０の配列において、式（Ｉ）中Ｌ１～Ｌ３に相当する部分の配列が１０％以上の配列同一性を有し、ＩｇＧ抗体分子に結合し得るポリヌクレオチド。 【0035】 ポリヌクレオチド（Ａ）について、付加、欠失、又は置換される塩基の数は、導入される場所によって異なるが、配列番号１～配列番号１０の配列において式（Ｉ）中、Ｐに相当する部分の配列では、１～５、１～３、又は１～２とすることができる。付加、欠失、又は置換される塩基の数は、配列番号４～配列番号９の配列において式（Ｉ）中、Ｌ１～Ｌ３に相当する部分の配列では、特に制限はなく、ＩｇＧ抗体分子に結合し得る範囲で設定することができ、例えば、それぞれ独立に、１～２０、１～１５、１～１０、１～８、１～５、１～３又は１～２とすることができ、これらを適宜組み合わせたものであってもよい。 【0036】 ポリヌクレオチド（Ｂ）について、式（Ｉ）中Ｌ１～Ｌ３に相当する部分の配列の配列同一性は、配列番号５～配列番号１０の配列において式（Ｉ）中Ｌ１～Ｌ３に相当する部分の配列については、特に制限はなく、ＩｇＧ抗体分子に結合し得る範囲で設定することができる。ポリヌクレオチド（Ｂ）について、式（Ｉ）中Ｌ１～Ｌ３に相当する部分の配列の配列同一性は、例えば、１０％以上、３０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上とすることができる。配列同一性は、当業界で公知の方法によって決定することができ、例えば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ, “Basic local alignment search tool,” J Mol Biol., 1990, 215(3), 403-410.（URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を参照することができる。 【0037】 抗体特異性アプタマーは、単一の構造を採り得るものを用いてもよく、複数の構造を採り得るものを用いてもよい。複数の構造を採り得るものを用いた場合には、抗体特異性アプタマーは、複数の構造を有するポリヌクレオチドの集合体であってもよい。複数の構造を採り得る集合体として用いる場合には、採り得る異なる構造体の比率には、特に制限はなく、存在し得る異なる構造体が同一に比率で存在する形態であることができ、異なる比 率で存在する形態であってもよい。異なる構造の集合体であることは、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence resonance energy transfer：ＦＲＥＴ）を利用した方法等の既知の方法によって確認できる。 【0038】 配列番号１～配列番号１０で示される配列を有するポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド（Ａ）及び（Ｂ）において、構成要素としての核酸は、上述したとおり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び人工核酸からなる群より選択される少なくとも１つであることができる。ポリヌクレオチドにおける核酸部分を選択することにより、ポリヌクレオチドが採り得る構造の数、種類、比率等を調整し得る。 配列番号１～配列番号１０で示される配列を有するポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド（Ａ）及び（Ｂ）において、構成要素としての核酸は、アプタマーの構造安定性、結合親和性の観点から、人工核酸とすることができる。人工核酸としては、架橋型核酸（Bridged Nucleic acid：ＢＮＡ。ロックド核酸（Locked nucleic acid：ＬＮＡ）とも称する ）、グリセロール核酸（Glycerol nucleic acid：ＧＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（Cyclohexenyl nucleic acid：ＣＮＡ）、スレオース核酸（Threose nucleic acid：ＴＮＡ）などが含まれる。 【0039】 本実施形態の抗体特異性アプタマーは、ＩｇＧ抗体分子に対して結合することができる。抗体特異性アプタマーが結合し得るＩｇＧ抗体分子には、血管内皮増殖因子（Vascular Endothelial Growth Factor：ＶＥＧＦ）に対する抗体分子が挙げられ、この例としては、ベバシズマブが挙げられる。ベバシズマブは、アミノ酸２１４個の軽鎖２分子とアミノ酸４５３個の重鎖２分子からなる糖タンパク質であり、分子量は約１４９０００の、ヒト血管内皮増殖因子に対するヒト化モノクローナル抗体である。ベバシズマブは、ヒトＶＥＧＦと特異的に結合することにより、血管内皮細胞上に発現しているＶＥＧＦ受容体とＶＥＧＦとの結合を阻害する機能を有する。 【0040】 抗体特異性アプタマーが結合し得る抗体分子は、抗体分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する分子であれば特に制限はなく、抗体全体又はその断片であってもよい。断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディー、単鎖抗体分子、及びＣＤＲを含む抗体断片からなる群より選択される少なくともひとつを挙げることができる。 【0041】 抗体特異性アプタマーは、公知のＳＥＬＥＸ（systematic evolution of ligand by exponential enrichment）法により得ることができる。 抗体特異性アプタマーを製造する好ましい方法は、 固相上に固定化された目的抗体を用いてＳＥＬＥＸ選択処理を行い、一本鎖ポリヌクレオチドからなる候補配列を得ること； それら候補配列を、異なる候補配列間での交叉と、候補配列のそれぞれに対する点ランダム変異とを行うことにより改変し、改変候補配列を得ること；並びに、 目的抗体に対する結合能に基づいて改変候補配列を選り分け、前記アプタマーを得ること、 を含む方法であってもよい。 【0042】 アプタマーを調製するための方法におけるＳＥＬＥＸ選択は当業者に公知であり、ＳＥＬＥＸ選択は公知の方法によって実施し得る。この方法では、標的分子（目的抗体）を固相上に固定化し、そこに、膨大な種類のランダムな塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーを加え、当該標的分子に結合するポリヌクレオチドを回収し、次いで、そのポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅し、その後、その増幅されたポリヌクレオチドを、再び標的分子が固定化されている担体へと加える。このプロセスを約１０回繰り返すことによって、その標的分子に対する高い結合能を有するアプタマーを 濃縮し、その配列を決定して、その標的分子を認識するアプタマーを得る。 【0043】 ＳＥＬＥＸ選択においては、目的抗体の固定化は、単に、例えば風乾によるなどの物理吸着によってか、又は、周知のアミンカップリング剤等を用いて目的抗体のカルボキシル基若しくはアミノ基を利用することにより目的抗体を固相に共有結合させることによって行われてもよい。目的抗体を固定化するための固相は、目的抗体を吸着する、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、濾紙、又はポリスチレンマイクロタイタープレート等のウェルであってもよいが、これらに限定されるものではない。 【0044】 ＳＥＬＥＸ選択用のポリヌクレオチドライブラリー中のポリヌクレオチドは、約３０ｍｅｒ～１００ｍｅｒのランダムな塩基配列を有しており、自動核酸合成機により合成されるが、これは、アプタマーのサイズが、通常、約１５ｍｅｒ～１００ｍｅｒであるためである。この場合には、それらポリヌクレオチドの全長がランダムな塩基配列であってもよいが、ＳＥＬＥＸを行う際にＰＣＲを単純化するために、それらポリヌクレオチドの両方の末端領域は既知の塩基配列であってもよい。この場合には、ＰＣＲプライマーを、これら既知配列の領域にそれぞれハイブリダイズさせることができる。それらポリヌクレオチドの両方の末端領域中に位置する当該領域のサイズは制限されず、通常は約１０ｍｅｒ～２５ｍｅｒである。 【0045】 続いて、上記に記載されているようにして作製したポリヌクレオチドライブラリーを、固定化された目的抗体と反応させる。好ましくは、ライブラリーと目的抗体との間の反応は室温で行ってもよい。反応時間は、通常は約１分～３０分、好ましくは約１０分～２０分であるが、これらに限定されるものではない。反応の際には、目的抗体に結合能を有するアプタマーは、目的抗体に結合し、固相上に固定化される。他方では、目的抗体に結合しないポリヌクレオチドは、固相に結合せず、したがって、洗浄により除去される。 【0046】 固相に結合しないポリヌクレオチドを洗浄により除去した後に、目的抗体に結合したアプタマーを溶出する。溶出は、例えば、固相を約６Ｍ～８Ｍの高い濃度の尿素で処理することによって行うことができる。溶出したポリヌクレオチドは、例えばフェノール抽出及び／又はフェノール－クロロホルム抽出とエタノール沈殿といった従来の方法によって回収することができる。回収されたアプタマーは、すべて、固定化された目的抗体に結合するものである。 【0047】 続いて、回収したアプタマーを鋳型として用いてＰＣＲを行い、これらアプタマーを増幅する。自動的に合成されたポリヌクレオチドが両方の末端領域に上記のプライマー結合領域を有する場合には、それらプライマーを用いてＰＣＲを行う。このようなプライマー結合領域を有しない場合には、回収したアプタマーのポリヌクレオチド配列を決定し、それぞれの末端領域に相補的な一対のＰＣＲプライマーを合成し、これらのプライマーを、ＰＣＲを行うために使用する。非対称ＰＣＲ（ＰＣＲに用いられる一対のプライマーの一方が、過剰量で使用される）を行うことにより、主に一本鎖ポリヌクレオチドを増幅することができる。あるいは、ＰＣＲにおいて用いられるプライマーのうちの１つとしてビオチン標識プライマーを使用すること；その増幅された二本鎖ポリヌクレオチドをアビジンビーズに結合させること；この状態でポリヌクレオチドをＮａＯＨ等により変性させること；及び、ビーズから分離したポリヌクレオチドを回収することにより、増幅された二本鎖ポリヌクレオチドから一本鎖ポリヌクレオチド（ビオチン標識されていない鎖）を回収することができる。これにより、固定化された目的抗体に結合するアプタマーだけが増幅され、また、固定化された目的抗体によく結合するもの、及び、ＰＣＲにおいて鋳型として働くものであるアプタマーの分子の数は多いため、増幅されたポリヌクレオチドのライブラリーにおけるそのパーセンテージは高くなる。 【0048】 続いて、増幅されたアプタマーのライブラリーを上記のポリヌクレオチドライブラリーとして用いて、上記の一連の工程、すなわち、固定化された試験物質との反応；洗浄；アプタマーの溶出及び回収；並びにＰＣＲによる増幅；の一連の工程によるサイクルを約数回から十数回、繰り返す。これにより、当該試験物質によく結合するアプタマーは濃縮され、当該試験物質に対する高い結合能力を有するアプタマーを得ることができる。 【0049】 ＳＥＬＥＸ選択の後、改変候補配列を得るために、遺伝的アルゴリズム（ＧＡ）を用いて候補配列の改変を行うことができる。改変においては、候補配列は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで進化させる。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの進化の適用により、所望のアプタマーの作出の効率を上昇させることが可能である。ＧＡを用いた改変は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５年、３３（１２）、ｅ１０８及びＡｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ．， Ｅｄ． ２００５年、３３、１０６１～１０６５等に記載されている。 【0050】 一態様に係る抗体検出方法は、検査対象の免疫グロブリンＧ抗体分子を含有する可能性がある試料を準備すること、本明細書記載の抗体特異性アプタマーを、準備された試料と接触させることを含む。抗体特異性アプタマーは、ＩｇＧ抗体のイディオタイプを認識可能であり、目的とする抗体が試料中に存在している場合には、効率よく検出することができる。 【0051】 本方法に用いられる試料としては、検査対象のＩｇＧ抗体分子を含有する可能性がある試料であればよく、固体、液体、ゲルなどの半固体であってよい。液体試料としては、体液試料を挙げることができ、体液試料としては、血清、血漿、又はそれらの希釈物等が挙げられる。ただし、試料は、これらに限定されるものではない。 検査対象からの体液試料を上記アプタマーと接触させることができる。試料中の目的抗体の検出又は測定は、通常の公知方法によって行ってもよい。例えば、イムノクロマトグラフィ又はＥＬＩＳＡなどのようなイムノアッセイを、抗体の代わりにアプタマーを用いて行うことが可能である。更に、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）を用いた検出方法又はアプタマーブロッティング法等を、本発明の診断に適用させてもよい。あるいは、ＷＯ２００５／０４９８２６及びＷＯ２００７／０８６４０３に記載されている検出法又はアッセイ法も適用可能である。 【0052】 抗体特異性アプタマーと用いた目的抗体の検出及び測定には、感度、精度及び迅速な定量の観点から、免疫アフィニティ磁気ビーズと、高温逆相液体クロマトグラフィー（ＨＴ－ＲＰＬＣ）蛍光検出法を適用することができる。 【0053】 抗体特異性アプタマーを用いる目的抗体の検出は、自動検出装置を用いて機械的に行われてもよい。この実施形態においては、試料とアプタマーとを含む検出試料を保持する試料保持部、その検出試料中の目的抗体とアプタマーとの複合体を検出することができる検出部、及び、検出部からの検出の結果を表示する表示部、を有する検出装置が提供され得る。この検出装置によれば、目的抗体の診断は、より容易に行われ得る。 【0054】 試料保持部は、検出試料を保持することができるいかなる形態を有していてもよい。検出試料は、検出部に提供された際に対象となる試料と抗体特異性アプタマーとを含んでいてもよい。 検出部は、目的抗体とアプタマーとの間の結合を検出することができる構成を有しており、目的抗体及びアプタマーの特異的検出方法に応じて選択されてもよい。検出方法の例としては、上述した例えばイムノクロマトグラフィ、ＥＬＩＳＡ又はＳＰＲ等のイムノアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。また、検出部の例としては、蛍光光度計又はＳＰＲ装置等が挙げられるが、これらに限定されない。更に、検出部は、検出結果を 検出データに変換する計算部を有する。よって、検出の結果はデータへと変換され得る。 【0055】 表示部は、検出部により得られた結果から作成された検出データを、ディスプレイに出力する。このディスプレイは、そうした目的のために使用されるいかなる公知のディスプレイであってもよい。 抗体特異性アプタマーは、試料中の目的抗体を高い信頼性で検出することができるため、抗体特異性アプタマーを、目的抗体検出用キットの１つの要素として使用してもよい。この実施形態においては、抗体特異性アプタマーを含むアプタマー溶液を含む第１の容器と、所望により設けられる、アプタマー溶液又は試料を希釈するために使用できる希釈剤を含む第２の容器と、所望により設けられる、抗体特異性アプタマーを用いた目的抗体の検出の手順を説明する文書と、を含む検出キットが提供され得る。 【実施例】 【0056】 以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。 【実施例】 【0057】 ［実施例１］ （１）ＳＥＬＥＸ法によるベバシズマブの抗イディオタイプアプタマーの獲得 ２４塩基のランダム領域を含むランダムＤＮＡライブラリー（配列番号１１）と、その５’末端及び３’末端のプライマー領域に相補的な配列（５’ ｂｌｏｃｋ：配列番号１２及び３’ ｂｌｏｃｋ；配列番号１３）を用意して、これらを、９５℃で１０分間熱処理を行い、その後に３０分間かけて室温まで徐冷した。その後、ベバシズマブ（中外製薬）を１０ｍｇ加え一晩インキュベートした。各配列は、表２に示した。 【実施例】 【0058】 その後、５０μＬのDynabeads（登録商標、以下、同じ） Protein Ａ（３０ｍｇ／ｍＬ、Thermo Fisher Scientific）を加え、３０分間インキュベートした。洗浄後、Dynabeads Protein ＡからＤＮＡを溶出するために、４００μＬのProteinase Ｋ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、２００ｍｇ／ｍＬ Proteinase Ｋ、ｐＨ７．４)中で、６０℃で３０分間インキュベートし、Dynabeads（以下、単に「ビーズ」ということがある）上のProtein Ａ及びベバシズマブを分解した。 その後フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿を常法に従って行い、ＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡに対して、TaKaRa Ex Taq（登録商標、以下、同じ） Hot Start Version（タカラバイオ株式会社）と、フォワードプライマー（配列番号１４）、リバー スプライマー（配列番号１５）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、最適なサイクル数と回収したＤＮＡ量を算出した。フォワードプライマー及びリバースプライマーの配列は、表２に示した。 【実施例】 【0059】 【表2】 【実施例】 【0060】 次いで、５’末端にビオチンを修飾したBio-Rev primer（表２参照、配列番号１６）を用いて最適なサイクル数でＰＣＲ増幅した。０．１５ＭのＮａＯＨを用いて一本鎖に調整した後、次ラウンドのライブラリーとしてＤＮＡを調製した。 【実施例】 【0061】 以上の操作をセレクション１ラウンドとし、セレクションを５ラウンド行った。６ラウンド目からのセレクションではDynabeads Protein ＡからのＤＮＡの溶出の操作として、４００ｍＬの１０ｎＭ ＶＥＧＦ（Recombinant HumanVEGF１６５ 、R&D SYSTEMS）中で９０分間インキュベートし、ベバシズマブのＣＤＲに結合したＤＮＡをＶＥＧＦと置換した。また１０ラウンド目からのセレクションでは、ヒトＩｇＧ（Human immunoglobulin G1 、Acris ANTIBODIES）を固定化したビーズとひとつ前のラウンドで獲得したＤＮＡプールをインキュベートすることでネガティブセレクションを行った。最終的に１４ラウンドのセレクションを行った後、得られたＤＮＡプールの配列を解析し、濃縮された配列を調べた。 【実施例】 【0062】 （２）ＥＬＯＮＡ法による認識部位の同定 １４ラウンドのセレクションにより得られたＤＮＡプールの配列を９６本解析した結果、６種類の重複した配列（配列番号１、１７～２１）が得られた。（表３参照）。 【実施例】 【0063】 【表3】 【実施例】 【0064】 これらの６種類のＤＮＡ配列をについて、ベバシズマブへの結合を確認するために、以下のＥＬＯＮＡ法（Enzyme Linked OligoNucleotide Assay）による結合評価を行った。 ９６穴プレートの各ウェルに２％ウシ胎児血清（ＢＳＡ）を加え６０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。ブロッキング後の各ウェルに、ベバシズマブを固定化したDynabeads Protein Ａを５μＬ（１０ｐｍｏｌ ベバシズマブ／ウェル）加え、磁気分離 により上清を回収し、ＰＢＳＴバッファー（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を用いて洗浄した。その後フォールディングした５００ｎＭのビオチン標識Ａ１４＃１～Ａ１４＃６をそれぞれ１００μＬ加え、６０分間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳバッファーを用いて１０００倍希釈したＨＲＰ修飾ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（NeutrAvidin（商品名）HRP Conjugate、Thermo Fisher Scientific）を１００μＬ加え、３０分間インキュベートした。再度洗浄後、ＨＲＰの基質を加え、プレートリーダーにより化学発光を測定した。また、ネガティブコントロールとしてチミンの連続配列（Poly_T、２４ｍｅｒ）をＤＮＡ溶液の代わりに加え、同様の実験を行った。またポジティブコントロールとして、ＤＮＡ溶液の代わりにビオチン修飾した抗ヒトＩｇＧ抗体を加え、同様の実験を行った。結果を図４に示す。 図４に示されるように、Ａ１４＃１及びＡ１４＃２において、Poly_Tに比べ強い化学発 光が観察された。このことからＡ１４＃１及びＡ１４＃２はベバシズマブに結合していることが示唆された。 【実施例】 【0065】 （３）競合ＥＬＯＮＡ法によるＡ１４＃１の認識部位の同定 次に最も強い結合を示したＡ１４＃１がベバシズマブのＣＤＲに結合しているか、以下にように、ＶＥＧＦとの競合ＥＬ１０ＮＡ法により評価した。 ９６穴プレートの各ウェルに２％ＢＳＡを加え６０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。ブロッキング後の各ウェルに、ベバシズマブを固定化したDynabeads Protein Ａを６．２５μＬ（１ｐｍｏｌベバシズマブ／ウェル）加え、磁気分離により上清を回収し、ＰＢＳＴバッファーを用いて洗浄した。その後フォールディングした２０ｎＭのビオチン標識Ａ１４＃１と、競合タンパクとして１０００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、又は２０ｎＭのＶＥＧＦを、１００μＬずつ加え、６０分間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳバッファーを用いて１００００倍希釈したＨＲＰ修飾ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎを１００μｍＬ加え、３０分間インキュベートした。再度洗浄後、ＨＲＰの基質を加えプレートリーダーによりＡ１４＃１の結合による化学発光を測定した。またネガティブコントロールとしてＶＥＧＦの代わりにトロンビン（Human Alpha-Thrombin、Hematologic Technologies Inc.）を加え同様の実験を行った。結果を図５（Ａ）に示す。 また、ビオチン標識化抗ヒトＩｇＧ抗体をＡ１４＃１の代わりに用いて同様の実験を行った。結果を図５（Ｂ）に示す。 【実施例】 【0066】 競合ＥＬＯＮＡ法では、Ａ１４＃１がベバシズマブのＣＤＲに結合していた場合、ＶＥＧＦ濃度依存的にＡ１４＃１の結合による化学発光が弱くなることを期待される。図５（Ａ）に示されるように、化学発光を測定した結果、ＶＥＧＦ濃度依存的に化学発光の減少が観察され、一方、トロンビンを用いた場合には、化学発光の減少は観察されなかった。 また、図５（Ｂ）に示されるように、ビオチン標識した抗ヒトＩｇＧ抗体をＡ１４＃１の代わりに用いた結果、ＶＥＧＦの存在に関わらず強い化学発光が観察された。 このことからＡ１４＃１は、ＶＥＧＦと競合していることが示され、即ち、ベバシズマブのＣＤＲに結合していることが示唆された。 【実施例】 【0067】 ［実施例２］ Ａ１４＃１の血清中での結合能評価 次に、Ａ１４＃１の血清中でのベバシズマブに対する結合能を、以下のように評価した。 ９６穴プレートの各ウェルに、２％ＢＳＡを加え６０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。ブロッキング後の各ウェルに、ビオチンを介してＡ１４＃１を固定化したMS300 StreptAvidinビーズ（Magnosphere MS300/streptavidin、JSR Life Sciences）を １００μＬ（５０ｐｍｏｌ Ａ１４＃１／ウェル）加え、磁気分離により上清を回収し、 ＰＢＳＴバッファーを用いて洗浄した。その後１％（ｖ／ｖ）管理血清プール Ｌ－コンセーラ ＩＥＸ（登録商標、以下、同じ。日水製薬）を用いて種々の濃度（０ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、５．０ｎＭ、又は１０ｎＭ）に希釈したベバシズマブを、それぞれ１００μＬ加え、６０分間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳバッファーを用いて１０００倍希釈したＨＲＰ融合抗ヒトＩｇＧ抗体（Goat Anti-Human IgG H&L (HRP) ab6858 (abcam)）を１００μＬ加え、３０分間インキュベートした。再度洗浄後、ＨＲＰの基質を加えプレートリーダーにより化学発光を測定した。またネガティブコントロールとして、ベバシズマブの代わりにヒトＩｇＧと、ヒト化モノクローナル抗体医薬品のひとつであるトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標、以下、同じ）、中外製薬）を用いて同様の実験を行った。 結果を図６に示す。 【実施例】 【0068】 図６に示されるように、化学発光を測定した結果、ベバシズマブに濃度依存的な化学発 光の増加が観察された。またヒトＩｇＧ及びトラスツズマブでは化学発光がほとんど観察されなかった。このことから血清中においてもＡ１４＃１はベバシズマブに特異的に結合できることが示された。 また、直線性の高い濃度範囲で検量線を作製し、定量限界を算出した。その結果定量限界は０．３ｎＭと算出された。このことからＡ１４＃１を用いることで、血清中の４．３μｇ／ｍＬのベバシズマブを検出することが可能である。 【実施例】 【0069】 ［実施例３］ Ａ１４＃１の特異性評価 Ａ１４＃１の特異性を更に評価するために、Ａ１４＃１を固定化した磁気ビーズを以下のように調製し、これを用いて、更に種々のヒトモノクローナル抗体に対する特異性を評価した。 ２ｍｇのストレプトアビジン修飾DynabeadsにＰＢＳバッファー３００μＬを加え、３ ０秒撹拌後、磁石でビーズを捕集し、上清を除去した。捕集したビーズに、ＰＢＳバッファー１００μＬ、１００μＭビオチン化Ａ１４＃１の水溶液５０μＬを加え、２０分間撹拌した。上清を除去後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳバッファー１００μＬで３回洗浄後、ＰＢＳバッファー１００μＬを加え、アフィニティービーズ分散液とし、これを冷蔵庫で保存した。 【実施例】 【0070】 作製したアフィニティービーズ分散液（２０ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）を撹拌後、磁石にて捕集し、上清を除去した。ヒトモノクローナルＩｇＧ抗体５種（ベバシズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、トシリズマブ）を各２０μｇ／ｍＬ水溶液として準備し、それぞれ、全量１００μＬとなるようにＰＢＳバッファーで希釈した後、捕集されたＡ１４＃１固定化磁気ビーズを添加して、室温で１時間撹拌した。その後、磁石によりビーズを捕集し、上清を除去後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳバッファー１００μＬで３回洗浄した。最後に０．１Ｍ水酸化ナトリウム１００μＬを加え、３分間撹拌し、各抗体を溶出した。 使用したヒトモノクローナルＩｇＧ抗体は以下のとおりである。これらの製剤を水で希釈して、目的濃度に調整した後に使用した。以下の「＊」は登録商標であることを表す。 ベバシズマブ（アバスチン＊点滴静注用100mg/4mL、中外製薬）、 インフリキシマブ（レミケード＊点滴静注用100、田辺三菱製薬）、 トラスツズマブ（ハーセプチン＊注射用60、中外製薬）、 セツキシマブ（アービタックス＊注射液100mg、メルクセローノ）、 トシリズマブ（アクテムラ＊点滴静注用200mg、中外製薬）。 【実施例】 【0071】 得られた上清２μＬを、以下の条件による高温逆相液体クロマトグラフィー（HT-RPLC ）－自然蛍光検出法によって分析した。 ＨＴ－ＲＰＬＣ－自然蛍光検出には，超高速液体クロマトグラフ Prominence UFLC（ 島津製作所）を使用した。カラムには、Kinetex（登録商標） 2.6 μ Ｃ18 100A（１００×２．１ｍｍ ｉ．ｄ．２．６μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を７５℃で使用し、流速０．２ｍＬ／分、注入量は２μＬに設定した。移動相には（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有Ｈ２Ｏ、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有イソプロパノール－アセトニトリル－Ｈ２Ｏをグラジエント条件（Ｂ％）１０％０－１分、１０％－２５％１－２分、２５％－５０％２－１５分、１００％１５．０１－２０分、１０％２０－２８分とした。また、自然蛍光検出波長は、Ｅｘ２７８ｎｍ、Ｅｍ．３４３ｎｍとした。 結果を図７に示す。図７に示されるように、Ａ１４＃１は、ベバシズマブに対して高い特異性を示すことがわかった。 【実施例】 【0072】 ［実施例４］ 多量体化Ａ１４＃１の作製及び結合評価 多量体化Ａ１４＃１の結合能について、以下のように評価した。 （１）多量体化Ａ１４＃１の作製 多量体化Ａ１４＃１としてのＴ１６（配列番号４）、Ｔ３０（配列番号５）、Ｔ４４（配列番号６）、ＡＴ１６（配列番号７）、ＡＴ３０（配列番号８）及びＡＴ４４（配列番号９）を、ポリヌクレオチド配列に従ってそれぞれ合成した。 【実施例】 【0073】 （２）多量体化Ａ１４＃１の結合能評価 作製されたダイマー化Ａ１４＃１のうち、Ｔ４４及びＡＴ４４を、以下のようにして、ビオチンを介して、それぞれMagnosphere MS300/streptavidin（JSR Life Sciences、以 下、同じ）に固定した。Magnosphere MS300/streptavidinを単にビーズという場合がある。 ３００μｇのMagnosphere MS300/streptavidinにＰＢＳバッファー３００μＬを加え、を３０秒撹拌後、磁石でビーズを捕集し、上清を除去した。捕集したビーズに、ＰＢＳバッファー１００μＬ、１μＭビオチン化Ｔ４４又はＡＴ４４の水溶液５００μＬを加え、３０分間撹拌した。上清を除去後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳバッファー１００μＬで３回洗浄後、ＰＢＳバッファー１００μＬを加え、アフィニティービーズ分散液とし、これを冷蔵庫で保存した。各アフィニティービーズ分散液を、T４４固定化Magnosphere MS300/streptavidin又はＡＴ４４固定化Magnosphere MS300/streptavidinとして、以 下、用いた。 【実施例】 【0074】 ９６穴プレートの各ウェルに、２％（ｖ／ｖ）ＢＳＡを加え６０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。ブロッキング後の各ウェルに、Ｔ４４固定化Magnosphere MS300/streptavidin又はＡＴ４４固定化Magnosphere MS300/streptavidin を１００μＬ（５ ０ｐｍｏｌ Ｔ４４又はＡＴ４４／ウェル）加え、磁気分離により上清を回収し、ＰＢＳ Ｔバッファーを用いて洗浄した。 【実施例】 【0075】 その後ＰＢＳバッファーを用いて種々の濃度（０ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１２５ｎＭ）に希釈したベバシズマブを、それぞれ１００μＬ加え、６０分間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳバッファーを用いて１０００倍希釈したGoat Anti-Human IgG H&L (HRP) ab6858 (abcam)を１００μＬ加え、３０分間インキュベートした。再度洗浄後、ＨＲＰの基質を加えプレートリーダーにより化学発光を測定した。 結果を図８及び図９に示す。 【実施例】 【0076】 化学発光を測定した結果、Ｔ４４及びＡＴ４４いずれにおいても、ベバシズマブ濃度依存的なシグナルが得られた（図８及び図９参照）。得られたグラフからスキャチャードプロットを作製し、解離定数（ＫＤ）を算出した結果、Ｔ４４のＫＤは２９ｎＭ、ＡＴ４４のＫＤは５２ｎＭと算出された。Ａ１４＃１のＫＤは１２ｎＭである。従って、Ｔ４４及びＡＴ４４はいずれも、ベバシズマブに対する結合能を有することがわかった。 【実施例】 【0077】 ［実施例５］ （１）１Ｇ２４Ｃ、２Ｃ２３Ｇ及び１ＧＣ２ＣＧの作製 Ａ１４＃１の３’末端側及び５’末端側の塩基を１つ以上変更した１Ｇ２４Ｃ（配列番号２）、２Ｃ２３Ｇ（配列番号３）及び１ＧＣ２ＣＧ（配列番号４）を、ポリヌクレオチド配列に従って作製した。各ポリヌクレオチドの配列を表４に示す。下線部は、Ａ１４＃１との相違点を示す。 【実施例】 【0078】 【表4】 【実施例】 【0079】 （２）各ポリヌクレオチドの結合能評価 作製された１Ｇ２４Ｃ、２Ｃ２３Ｇ及び１ＧＣ２ＣＧと、Ａ１４＃１を、実施例４と同様にして、ビオチンを介して、それぞれMagnosphere MS300/streptavidin（JSR Life Sciences）に固定化した。 ９６穴プレートの各ウェルに、２％（ｖ／ｖ）ＢＳＡを加え６０分間インキュベートし、ブロッキングを行った。ブロッキング後の各ウェルに、各アプタマーを固定化したMagnosphere MS300/streptavidinを１００μＬ（５０ｐｍｏｌ アプタマー／ウェル）加え、 磁気分離により上清を回収し、ＰＢＳＴバッファーを用いて洗浄した。 【実施例】 【0080】 その後ＰＢＳバッファーを用いて種々の濃度（０ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１２５ｎＭ）に希釈したベバシズマブを、それぞれ１００μＬ加え、６０分間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳバッファーを用いて１０００倍希釈したGoat Anti-Human IgG H&L (HRP) ab6858 (abcam)を１００μＬ加え、３０分間インキュベートした。再度洗浄後、ＨＲＰの基質を加えプレートリーダーにより化学発光を測定した。 結果を図１０～図１３に示す。 【実施例】 【0081】 化学発光を測定した結果、Ａ１４＃１、１Ｇ２４Ｃ、２Ｃ２３Ｇ、１ＧＣ２ＣＧのいずれにおいてベバシズマブ濃度依存的なシグナルが得られた（図１０～図１３）。得られたグラフからスキャチャードプロットを作製し、ＫＤを算出した結果Ａ１４＃１のＫＤは１２ｎＭ、１Ｇ２４ＣのＫＤは１９ｎＭ、２Ｃ２３ＧのＫＤは２５ｎＭ、１ＧＣ２ＣＧのＫＤは２０ｎＭと算出された。従って、１Ｇ２４Ｃ、２Ｃ２３Ｇ、１ＧＣ２ＣＧはいずれも、ベバシズマブに対する結合能を有することがわかった。 【実施例】 【0082】 本実施形態に係るアプタマーは、イディオタイプアプタマーとして有用であることがわかる。即ち、抗体可変部は、比較的親水性かつ構造自由度が高いという性質を有し、抗原は水素結合や水分子を介して可変部のＣＤＲと結合する。本アプタマーは、このように構造の自由度が高いＣＤＲに対して高い特異性を示すという利点を有する。 従って、本実施形態に係るアプタマーは、特定の目的抗体に特異性を有し、目的抗体の検出に有用であることがわかる。 |
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| 図面 |
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