AP(BW , GH , GM , KE , LR , LS , MW , MZ , NA , RW , SD , SL , ST , SZ , TZ , UG , ZM , ZW) , EA(AM , AZ , BY , KG , KZ , RU , TJ , TM) , EP(AL , AT , BE , BG , CH , CY , CZ , DE , DK , EE , ES , FI , FR , GB , GR , HR , HU , IE , IS , IT , LT , LU , LV , MC , MK , MT , NL , NO , PL , PT , RO , RS , SE , SI , SK , SM , TR) , OA(BF , BJ , CF , CG , CI , CM , GA , GN , GQ , GW , KM , ML , MR , NE , SN , TD , TG) , AE , AG , AL , AM , AO , AT , AU , AZ , BA , BB , BG , BH , BN , BR , BW , BY , BZ , CA , CH , CL , CN , CO , CR , CU , CZ , DE , DJ , DK , DM , DO , DZ , EC , EE , EG , ES , FI , GB , GD , GE , GH , GM , GT , HN , HR , HU , ID , IL , IN , IR , IS , JP , KE , KG , KN , KP , KR , KW , KZ , LA , LC , LK , LR , LS , LU , LY , MA , MD , ME , MG , MK , MN , MW , MX , MY , MZ , NA , NG , NI , NO , NZ , OM , PA , PE , PG , PH , PL , PT , QA , RO , RS , RU , RW , SA , SC , SD , SE , SG , SK , SL , SM , ST , SV , SY , TH , TJ , TM , TN , TR , TT , TZ , UA
【0039】 ラミニンのE8フラグメントは、マウスラミニンα1β1γ1(以下、「マウスラミニン111」とも記す。)をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである(Edgar D., Timpl R., Thoenen H. The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival. EMBO J., 3:1463-1468, 1984.、Goodman SL., Deutzmann R., von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105:589-598, 1987.)。例えば、ヒトラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン111のE8フラグメント(マウスラミニン111E8)に相当するフラグメントの存在が推定されるが、これらを分離・同定したことは報告されていない。したがって、本発明に用いられるヒトラミニンのE8フラグメントは、対応するヒトラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、マウスラミニン111E8と同様の細胞接着活性を有し、同様の構造を有し、同程度の分子量を有するヒトラミニンのフラグメントであればよい。
【0041】 組換えヒトラミニン(全長またはその一部)は、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えヒトラミニン211E8の製造方法を例として以下説明する。組換えヒトラミニン211E8の製造方法としては、例えば、ヒトラミニン211E8のα鎖、β鎖およびγ鎖の各タンパク質をコードするDNAをそれぞれ取得し、これをそれぞれ発現ベクターに挿入し、得られた3種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、3量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造できる。例えば、Idoら(Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.)に記載の方法に従って作製することができるが、これに限定されるものではない。例えばヒトラミニン211を構成するα2鎖、β1鎖、γ1鎖をそれぞれコードする遺伝子(cDNA)の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、表1に記載したアクセッション番号で公知のデータベース(GenBank等)から取得することができる。表1にラミニンを構成するα鎖、β鎖、γ鎖の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報の一例を記載する。第1のラミニンは、筋衛星細胞との接着性を有していればよく、例えば、これら特定のアミノ酸配列において、少なくとも1個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたタンパク質であってもよい。
【0058】 (筋衛星細胞) 本実施形態の培養方法に用いる筋衛星細胞は、動物の筋衛星細胞であることが好ましく、哺乳動物の筋衛星細胞であることがより好ましく、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、サルまたはヒトの筋衛星細胞であることがさらに好ましく、ヒトまたはマウスの筋衛星細胞であることがさらに好ましく、ヒトの筋衛星細胞であることが特に好ましい。筋衛星細胞は、組織から分離した筋衛星細胞であることが好ましく、ヒトまたはマウス等の動物の組織からフローサイトメーター(FACS(fluorescence activated cell sorting))等を用いて分離してもよい。組織から筋衛星細胞を分離する方法は、例えば、Fukada S, Higuchi S, Segawa M et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp Cell Res 2004;296:245-255.を参照してもよい。別の態様として、ES細胞またはiPS細胞から筋衛星細胞を作製してもよい。
【0059】 (培地) 本実施形態の培養方法で使用する筋衛星細胞の未分化維持用の培地は、特に限定されないが、合成培地が好ましく、異種成分を含まない(ゼノフリー)合成培地が特に好ましい。市販または市販予定の合成培地としては、mTeSR1(商品名、StemCell Technologies)、TeSR2(商品名、StemCell Technologies)、StemPro hESC SFM(商品名、Invitrogen)、hESF-GRO(商品名、株式会社細胞科学研究所)等が挙げられる。このうちTeSR2が異種成分を含まない培地である。本願の実施例においては、未分化培地として、DMEM with GlutaMAX(Life Technologies社製)、20% fetal bovine serum(FBS; Sigma-Aldrich社製)、1% Chick Embryo Extract(US Biological社製)、100units/ml penicillin and 100μg/ml streptomycin(Life Technologies社製)、および5ng/ml basic-FGF(ReproCell社製)の混合培地が用いられている。また、以下の文献(1)~(5)に記載された培地も必要に応じて適宜改変を加えて用いられうる。 (1) Liu, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 346:131-139, 2006. (2) Vallier, L. et al., J. Cell Sci. 118:4495-4509, 2005. (3) Li, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 91:688-698, 2005. (4) Yao, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6907-6912, 2006. (5) Lu, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:5688-5693, 2006.