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明細書 :融合細胞株とその取得方法

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第3536076号 (P3536076)
公開番号 特開平11-187867 (P1999-187867A)
登録日 平成16年3月26日(2004.3.26)
発行日 平成16年6月7日(2004.6.7)
公開日 平成11年7月13日(1999.7.13)
発明の名称または考案の名称 融合細胞株とその取得方法
国際特許分類 C12N  5/06      
FI C12N 5/00 E
請求項の数または発明の数 2
全頁数 6
出願番号 特願平10-061889 (P1998-061889)
出願日 平成10年2月27日(1998.2.27)
優先権出願番号 1997306360
優先日 平成9年10月22日(1997.10.22)
優先権主張国 日本国(JP)
審査請求日 平成12年4月17日(2000.4.17)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】501203344
【氏名又は名称】独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構
【識別番号】000195568
【氏名又は名称】生物系特定産業技術研究推進機構
発明者または考案者 【氏名】辻 顕光
【氏名】山本 万里
【氏名】長田 和浩
【氏名】川原 浩治
個別代理人の代理人 【識別番号】100074077、【弁理士】、【氏名又は名称】久保田 藤郎 (外1名)
審査官 【審査官】鈴木 美葉子
参考文献・文献 特開 昭61-234778(JP,A)
特開 昭61-271986(JP,A)
特開 昭61-271984(JP,A)
Biochem Biophys Res Commun(1988),Vol.152,No.3,p.1401-1409
日本農芸化学会誌(1997),Vol.71,臨時創刊号,p.274 4la2
Kitasato Arch. of Exp. Med(1988),Vol.61,No.4,p.225-235
日本臨床免疫学会会誌(1988),Vol.11,No.4,p.346-356
J. Fac. Agr. Kyusyu Univ.(1995),Vol.40,No.1-2,p.223-231
調査した分野 C12N 5/00
特許請求の範囲 【請求項1】
ヒトT細胞性白血病細胞株PEERから、8-アザグアニン耐性クローンを選択し、さらに無血清培養可能にした変異株であるICLU-Tを親細胞株とするヒト免疫担当融合細胞株。

【請求項2】
ヒト細胞融合用親細胞株ICLU-Tとヒト免疫担当細胞を用いて融合細胞を作成する際に、ポリエチレングリコールとレシチンの存在下に行うことを特徴とするヒト免疫担当融合細胞株の取得方法。
発明の詳細な説明 【発明の詳細な説明】

【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、融合細胞株とその取得方法に関する。詳しくは、ヒト細胞株を用いた免疫系の諸現象、すなわちアレルギー、ガンなどのメカニズム解明、それらの疾病の予防、診断、治療等を目的とした食品機能の検索、新規医薬品の探索、製造に使用するためのヒト免疫担当細胞株の取得に関するものである。

【0002】
【従来の技術】一般に、ヒトの体内から分離した細胞を体外で培養するには、困難を伴うことが多い。例えば、ヒトの体内から分離したリンパ球などの細胞を体外で無限増殖させることは困難である。通常、これら細胞を培養液中で培養しても、2週間から数ヶ月程度で死滅してしまう。ガン細胞や上皮細胞のある種のものは、培地組成によっては体外での継代培養が可能であるが、研究等に用いるために必要十分な量を確保することは難しい。さらに、体内細胞を体外において増殖させるには、細胞に何らかの刺激を与える必要がある。そのために、培養液に種々の生理活性物質を添加しなければならないが、その適切な物質の選択等に問題があり、かなりの労力を要する。

【0003】
近年では、このような問題点を解消する方法として、目的とする細胞に発ガン物質等の薬剤を添加したり、紫外線や放射線を照射する等の処理を行い、目的の細胞に突然変異を生じさせる(トランスフォーム)方法が提案されている。このような処理を行うことにより、無限増殖が可能な細胞株(変異株)を取得することができる。また、遺伝子導入法(細胞に特定の遺伝子を導入する方法)を用いて、株化したい細胞に、不死化遺伝子を導入して形質転換を生じさせ、無限増殖する細胞を取得する方法も報告されている。

【0004】
さらに、このようにトランスフォームを利用した方法のほかに、リンパ球などのように体内で抗体や免疫調節因子(リンフォカイン)を産生する細胞を、無限増殖する細胞と融合して、体外でもその抗体や免疫調節因子を産生する融合細胞(ハイブリドーマ)として樹立する方法も知られている。

【0005】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これらの従来の方法では、次のような問題点があった。まず、薬剤を添加する方法や紫外線等の照射を利用する方法においては、獲得した変異形質およびその他の細胞機能が安定した細胞株として樹立するために、数カ月から数年もの長期間を要し、樹立した細胞株が利用できるようになるまでにかなりの期間が必要であった。また、処理に供した細胞数あたりの取得される変異株数(変異効率)が低く、目的細胞を容易に株化することが困難であった。

【0006】
また、細胞融合によって株化する方法は、モノクローナル抗体やリンフォカイン等の細胞由来物質の安定生産系としては有用である。しかしながら、この方法で得られる融合細胞株は、生体内で生じる種々の免疫反応に対しては、その細胞応答が低下もしくは消失していると言われている。したがって、これらの方法を用いても、生体内での細胞の相互作用を生体外でも再現可能な樹立細胞系として用いるためには多くの困難が伴った。

【0007】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、株化細胞の取得法について検討を重ね、細胞融合法による株化がその他の方法に比較して、細胞をトランスフォームさせる効率が比較的高い点に着目した。ただし、細胞融合して得られる株細胞の性質は、融合に供した生体由来の免疫担当細胞ばかりでなく、他方のパートナーであるヒト親細胞株に大きく依存していることが知られている。

【0008】
そこで、種々のヒト由来の免疫担当細胞を細胞機能を保持したまま効率よく株化するために、本発明者らは親細胞株について研究し、変異株であるヒトT細胞性白血病細胞株ICLU-Tを樹立した。このヒト親細胞株を用いて、生体内の各種ヒト免疫担当細胞と細胞融合することにより得られる融合細胞は、細胞が生体内で有していたと考えられる細胞機能を保持する性質を残していることが分かった。

【0009】
また、この細胞融合用親細胞株であるICLU-Tは、よく知られている細胞融合促進剤(ポリエチレングリコール、以下PEGと記載する。)および融合細胞のみを増殖させる融合細胞選択培地(HAT培地)では、効率的な細胞融合を行うことは不可能であることが判明した。そこで、本発明者らは、ICLU-Tを親細胞株として利用し、融合細胞を得るための手段について検討した結果、PEGとリン脂質であるレシチンを混合した融合促進剤を開発すると共に、ヒポキサンチンとアメソプテリンで構成される選択培地を開発した。その結果、これらを用いることにより、効率よく細胞融合を行うことができることを見出した。なお、本発明で用いるヒト細胞融合用親細胞株ICLU-Tは、必ずしも免疫担当細胞とのみ融合可能なわけではなく、その他の組織由来の細胞とも融合可能である。

【0010】
請求項1記載の本発明は、ヒトT細胞性白血病細胞株PEERから、8-アザグアニン耐性クローンを選択し、さらに無血清培養可能にした変異株であるICLU-Tを親細胞株とするヒト免疫担当融合細胞株である。

【0011】
また、請求項2記載の本発明は、ヒト細胞融合用親細胞株ICLU-Tとヒト免疫担当細胞を用いて融合細胞を作成する際に、PEGとレシチンの存在下に行うことを特徴とするヒト免疫担当融合細胞株の取得方法である。

【0012】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。融合細胞の性質は、前記したように、融合に供した生体由来の免疫細胞だけでなく、親細胞株にも大きく依存している。そこで、本発明者らは、種々のヒト由来の免疫担当細胞を細胞機能を保持したまま効率よく株化するために用いることができるヒト細胞融合用親細胞株を樹立した。すなわち、ヒト免疫細胞由来細胞から、次のようにして親細胞株を取得した。ヒトT細胞性白血病細胞株(PEER)は8-アザグアニン(終濃度20μg/ml)を含む10%牛胎児血清(以下、FBSと記載する。)を含むERDF培地(極東製薬工業(株)製)で培養した。なお、10%の濃度でFBSを添加したERDF培地を、以下10%FBS-ERDF培地と記載する。

【0013】
3週間程度培養した後、増殖してきたクローンを分取し、クローニングを行った。クローニングは、96穴培養プレートの1穴につき1個の細胞が入るように、10%FBS-ERDF培地を用いて細胞懸濁液を稀釈して巻き込む限界稀釈法に従った。96穴培養プレートに細胞をまきこんで24~30時間後に、プレートの各穴を検鏡し、細胞が2個になっている穴に印をいれた。さらに、24~30時間後(すなわち、まきこんでから48~60時間後)に、印がついている穴を検鏡し、細胞が4個になっている穴に印をいれた。まきこんでから20日後に、2つの印がついている穴を検鏡し、細胞が増殖していることを確認して細胞数を血球計算板で計測した。最も細胞数が多かった穴の細胞を、さらに上記と同様の方法で再クローニングした。

【0014】
親細胞株が樹立された後、細胞融合で得られる融合細胞が無血清培養可能となるように、クローニングで得られたクローンをインスリン(終濃度10μg/ml)、トランスフェリン(終濃度20μg/ml)、エタノールアミン(終濃度20μM)、亜セレン酸ナトリウム(終濃度25nM)を含むERDF培地(極東製薬工業(株)製)で、96穴培養プレートに、1穴につき1個の細胞が入るように稀釈して2週間程度培養した。増殖してきた各穴の細胞数を計測し、最も細胞数が多かった順に各穴の細胞の一部をアミノプテリン(終濃度0.4mM)を含む15%FBS-ERDF培地で培養した。培養後3日目~5日目に検鏡し、細胞が死滅したクローンの3、4株を親細胞株の候補として樹立した。

【0015】
得られた親細胞株の候補となるクローンを用いて実際に細胞融合した。その結果、使用した各クローンの細胞数を105 細胞としたときの取得した融合細胞数(融合効率)を指標として、この値が最も高いクローンを樹立親細胞株とした。このようにして樹立した親細胞株、すなわちPEER由来の親細胞株をヒトT細胞性白血病細胞株(ICLU-T)と命名した。このようにして樹立された親細胞株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号は、ICLU-TがFERM BP-6255である。この親細胞株を、ヒト末梢血リンパ球のようなヒト免疫担当細胞と融合操作を行うことにより、請求項1記載の融合細胞株を得ることができる。

【0016】
親細胞株とヒト免疫担当細胞との融合操作は、例えば以下のようにして行うことができる。まず、上記の親細胞株とヒト免疫担当細胞とを混合する。ここで、親細胞株と融合させる他方のヒト免疫担当細胞としては、ヒトリンパ球などのヒトの生体内で免疫機能を有する細胞であればいずれも使用できる。親細胞株に対するヒト免疫担当細胞の使用割合は、例えば親細胞株としてICLU-Tを使用する場合は0.8~1.2倍とするのが好ましい。

【0017】
また、ヒト免疫担当細胞の代わりに、その他のヒト組織由来の細胞、例えばヒトガン細胞などを用いて融合させることも可能である。ガン細胞を用いる場合、該細胞の由来する組織の種類は特に限定されず、例えば胃ガン細胞や乳ガン細胞など、いずれも同じように使用することができる。この場合、親細胞株に対するこれら細胞の使用割合は、上記と同様でよい。

【0018】
親細胞株とヒト免疫担当細胞等の混合物を遠心分離することにより、培養上清と細胞ペレットとに分離し、このうちの培養上清を除去する。残った細胞ペレットに、融合促進剤であるPEGを基本合成培地で希釈したもの(通常は、40~50%に希釈)を添加する。ここで用いる培地としては、例えば基本合成培地としてERDF培地、RPM11640培地、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)などが使用可能である。これらの培地と共に、成長因子として牛胎児血清(FBS)を併用したり、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウムなどの無血清培養用成長因子を併用することもできる。また、融合促進剤であるPEGとしては、平均分子量が4,000~6,000程度のものを使用できるが、融合効率の点から平均分子量4,000程度のものが好ましく、ICLU-Tの場合は平均分子量4,000程度のものが特に好ましい。

【0019】
ところで、親細胞株としてICLU-T細胞を用いた場合は、融合促進剤としてPEGにレシチンを混合したものを使用する必要がある。PEGにレシチンを混合せずに、ICLU-T細胞の細胞融合操作を行った場合、ICLU-Tの細胞膜破壊が顕著に生じ、残存する生細胞数が減少する上に、目的とする融合細胞を効率よく得ることができない。レシチンは、細胞膜の主たる構成成分であるリン脂質の一種である。このレシチンを混合すると、ICLU-T細胞を用いた融合操作を行った場合に、細胞膜の主成分であるリン脂質を保護し、PEGによる細胞膜破壊を極力抑えることができる。

【0020】
培地で希釈された融合促進剤を添加した細胞ペレットを遠心分離した後、該細胞ペレットの中から融合細胞を選択する。

【0021】
ICLU-Tを親細胞株として用いた場合の融合細胞の選択は、ヒポキサンチンおよびアミノプテリン(代わりに、アメソプテリンでもよい。以下、同じ)を含むが、チミジンを含まない培地で構成された選択培地を使用する。ICLU-T細胞を親細胞とする場合、選択培地にチミジンが存在すると、増殖阻害が生じるため、チミジンの添加を避けるべきである。融合後24~30時間経過した後、懸濁液にヒポキサンチンとアミノプテリンを含有した選択培地(例えば、15%FBS-ERDF培地)を添加する。この培地は、上記と同様に、数日おきに半量ずつ交換する。このようにして2週間程度培養することにより、融合細胞を取得することができる。親細胞から融合操作を経て得られる融合細胞は、生体内において当該免疫担当細胞が発現していた特定の免疫反応(細胞機能)を、生体外でもそのまま保持することができる。

【0022】
【実施例】次に、本発明を詳細に説明するために代表的な実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例1〔ICLU-Tを用いたヒトリンパ球の株化〕ICLU-T(FERM BP-6255)を4×106個、ヒト末梢血リンパ球を4×106個で混合した。この混合物を遠心分離し、培養上清と細胞ペレットとに分離した後、培養上清を除去した。細胞ペレットに基本培地であるERDF培地(極東製薬工業(株)製)と1%レシチンで調製した40%PEG(平均分子量:4000)を1ml添加した。さらに、ERDF培地9mlを添加して、全量を10mlとした。これを再び遠心分離して得られた細胞のペレットを、ERDF培地85%、FBS15%になるように調製された15%FBS-ERDF培地25mlで懸濁した。懸濁液は、96穴培養プレートの各穴に100μlずつ添加した。この融合操作の4日後に、133μMヒポキサンチン、0.26μMアメソプテリン含有15%FBS-ERDF培地を96穴培養プレートの各穴に100μlずつ添加した。次いで、4、5日おきに、67μMヒポキサンチン、0.13μMアメソプテリン含有15%FBS-ERDF培地と半量ずつ培地交換した。培養開始から2週間程度経過後に、形成されたICLU-Tとヒト末梢血リンパ球との融合細胞の出現ウェル数および融合効率を測定した。結果を第1表に示す。また、ICLU-T(FERM BP-6255) 5×106個とヒト末梢血リンパ球5×106個とを用いたこと以外は、上記と同様の条件で細胞融合を行った。その結果も第1表に示す。

【0023】
次に、得られた融合細胞株の性質を、下記のようにして検討した。まず、蛍光標識した抗B細胞抗体、抗T細胞抗体および抗単球抗体を用いて、融合細胞がいずれの抗体に反応するかを検討した。この判別結果により、融合細胞が、B細胞性、T細胞性および単球性のいずれであるかを知ることができる。 この抗体による検討の結果、融合細胞がB細胞性であった場合は、抗体(Ig)産生能を有するか否かについてさらに検討した。また、融合細胞がT細胞性であった場合は、さらにどのようなサブクラスに分類されるかについて検討した。融合細胞が単球性であった場合は、食細胞作用等を有するかについても検討した。上記2回の融合操作により得られた融合細胞の細胞種とその比率等の平均値を第2表に示す

【0024】
【表1】第 1 表
JP0003536076B2_000002t.gif【0025】
【表2】第 2 表
JP0003536076B2_000003t.gif【0026】第1表より、親細胞株としてICLU-Tを用いた場合、2週間程度の培養で、高い効率のヒト末梢血リンパ球との融合細胞を得ることができることがわかる。また、第2表より、以下のことがわかる。まず、親細胞株は生体内の各種の免疫担当細胞を株化することができることが明らかである。ICLU-Tを細胞融合の親細胞株として使用した場合、主としてT細胞系の融合細胞を得ており、これらのT細胞種の融合細胞は、ヘルパー型を示す。したがって、細胞融合に供した末梢血リンパ球のうち、Tリンパ球の性質を受け継いでいることが明らかである。

【0027】
実施例〔親細胞株ICLU-Tを用いて細胞融合を行う場合の融合促進剤の検討〕ICLU-T細胞(FERM BP-6255)とヒト末梢血リンパ球とを、細胞数が約1:1(具体的な数値は第3表に示した)となるように混合した。この混合物を遠心分離し、培養上清と細胞ペレットとに分離し、培養上清を除去した。次に、細胞ペレットに基本培地であるERDF培地(極東製薬工業(株)製)と1%レシチンで調製した1%レシチン-40%PEG(平均分子量:4000)を1ml添加した。さらに、ERDF培地9mlを添加して全量を10mlとした。これを再び遠心分離して得られた細胞のペレットを、ERDF培地85%、FBS15%になるように調製された15%FBS-ERDF培地50mlで懸濁した。懸濁液は、96穴培養プレートの各穴に100μlずつ添加した。この融合操作の4日後に、133μMヒポキサンチン、0.26μMアメソプテリン含有15%FBS-ERDF培地を96穴培養プレートの各穴に100μlずつ添加した。次いで、4、5日おきに、67μMヒポキサンチン、0.13μMアメソプテリン含有15%FBS-ERDF培地と半量ずつ培地交換した。培養開始から2週間程度経過後に、形成されたICLU-Tとヒト末梢血リンパ球との融合細胞の出現ウェル数および融合効率を測定した。結果を第3表に示す。一方、対照として、レシチンを添加しないERDF培地で希釈して調製した40%PEG(平均分子量:4000)を用いた他は上記と同様に細胞融合を行った。その結果も第3表に併せて示す。

【0028】
【表3】第 3 表
JP0003536076B2_000004t.gif* 親細胞105個当たり

【0029】
第3表より、融合促進剤としてPEGのみを用いても、融合細胞が全く得られないか、あるいは得られる場合でもその効率は非常に低いことがわかる。一方、レシチンとPEGの両方を用いた場合は、融合細胞を効率よく得ることができることが明らかである。この結果から、ICLU-Tを親細胞として細胞融合を行う際は、融合促進剤としてPEGの他にレシチンも添加する必要があることがわかる。

【0030】
【発明の効果】ICLU-Tを親細胞株として用いて作成された本発明のヒト免疫担当融合細胞株は、生体内において当該免疫担当細胞が元来有していた免疫機能、その他の性質を生体外においてそのまま発現するものである。また、請求項2記載の本発明方法のように、ポリエチレングリコールとレシチンの存在下において、ICLU-Tとヒト免疫担当細胞から融合細胞を作成すると、生体内における免疫機能をそのまま保持した融合細胞を効率よく株化することができる。本発明の融合細胞株は、生体内での細胞間相互作用を、生体外で研究するために好適に利用することができる。本件は、(旧)独立行政法人農業技術研究機構と(旧)生物系特定産業技術研究推進機構との共同出願でありましたが、平成15年10月1日付けで両者が統合され、特許出願人欄に記載の名称となりました。なお、(旧)生物系特定産業技術研究推進機構の名称変更届は関係書類が整い次第提出いたします。