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METHOD FOR INDUCING DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS INTO BRAIN MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS

Foreign code F200010010
File No. (S2018-0394-N0),S2020-0001-N0
Posted date Jan 29, 2020
Country WIPO
International application number 2019JP017799
International publication number WO 2019208736
Date of international filing Apr 25, 2019
Date of international publication Oct 31, 2019
Priority data
  • P2018-087670 (Apr 27, 2018) JP
Title METHOD FOR INDUCING DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS INTO BRAIN MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS
Abstract The present invention addresses the problem of providing: a method for inducing the differentiation of pluripotent stem cells into cerebrovascular endothelial cells capable of forming tight junctions that are stable and can be maintained for a long period of time; and a use for said method. In the present invention, the differentiation of pluripotent stem cells into brain microvascular endothelial cells is induced by means of: a step (1) of cultivating pluripotent stem cells in the absence of FGF2 and reducing undifferentiation; and a step (2) of differentiating the cells obtained in step (1) into brain microvascular endothelial cells, said step including cultivation in the presence of FGF2, retinoic acid and a TGF-β inhibitor.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
(BBB) is the blood-brain barrier, brain blood regulate the transport of the molecule between the very important biological has a barrier function. BBB (BMEC) brain capillary endothelial cells and is configured, the various junctions a strong discharge is characterized by the expression of transporters.
In the development of new drugs, BBB permeability to know the effectiveness of pharmaceuticals or safety which is essential for the prediction, and thus it is desirable the use of a normal human brain vascular tissue, normal human brain vascular tissue is available in itself is difficult. Therefore, using an experimental animal or tumor cells have been tested, they are compared with the human tissue is different from the functionality in question. Incidentally, the monkey or rat-derived cells BBB in vitro with the cells of the reconstruction model is commercially available (monkey-BBB kit TM, rat BBB-TM(manufactured by famakoseru) kit).
In recent years, an embryonic stem cell (embryonic stem cells: ES cells) and in the same manner as ES cells and multipotent has a function of the almost infinite growth, may be used to study drug discovery has been expected an induced pluripotent stem cell (induced pluripotent stem cells: iPS cell) has been developed using the BBB model (for example Patent Document 1, 2, see Non-Patent Document 1).
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
 以下の工程(1)及び(2)を含む、多能性幹細胞を脳毛細血管内皮細胞へ分化誘導する方法:
 (1)多能性幹細胞をFGF2非存在下で培養し、未分化性を低下させる工程;
 (2)工程(1)で得られた細胞を脳毛細血管内皮細胞へと分化させる工程であって、FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤の存在下での培養を含む工程。

[請求項2]
 工程(1)の培養に、血清又は血清代替物、非必須アミノ酸、L-グルタミン酸及び2-メルカプトエタノールを含有する培地を用いる、請求項1に記載の方法。

[請求項3]
 工程(2)の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用いる、請求項1又は2に記載の方法。

[請求項4]
 工程(1)の培養期間が3日間~9日間である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。

[請求項5]
 工程(2)の培養期間が2日間~10日間である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。

[請求項6]
 工程(2)によって形成された細胞層の経内皮電気抵抗値が1000Ω×cm 2以上である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。

[請求項7]
 工程(2)によって形成された細胞層が、1000Ω×cm 2を超える経内皮電気抵抗値を5日以上維持する、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。

[請求項8]
 工程(2)が、(2-1)FGF2及びレチノイン酸の存在下での培養と、該培養の後に行われる、(2-2)FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤の存在下での培養からなる、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。

[請求項9]
 工程(2-1)の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、及びレチノイン酸を含有する培地を用い、工程(2-2)の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用いる、請求項8に記載の方法。

[請求項10]
 工程(2-1)の培養期間が1日間~5日間であり、工程(2-2)の培養期間が1日間~4日間である、請求項8又は9に記載の方法。

[請求項11]
 工程(2)が、(2-1)FGF2及びレチノイン酸の存在下での培養と、該培養の後に行われる、(2-2)FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤の存在下での培養と、該培養の後に行われる、(2-3)TGF-β阻害剤の存在下での培養からなる、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。

[請求項12]
 工程(2-1)の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、及びレチノイン酸を含有する培地を用い、工程(2-2)の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用い、工程(2-3)の培養に、血清又は血清代替物、及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用いる、請求項11に記載の方法。

[請求項13]
 工程(2-1)の培養期間が1日間~5日間であり、工程(2-2)の培養期間が1日間~4日間であり、工程(2-3)の培養期間が1日間~4日間である、請求項11又は12に記載の方法。

[請求項14]
 TGF-β阻害剤がA-83-01、SB-431542、RepSox、SB-505124、SB-525334、LY-2157299、LY-364947、SD208及びD4476からなる群より選択される一以上の化合物である、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。

[請求項15]
 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項1~14のいずれか一に記載の方法。

[請求項16]
 人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項15に記載の方法。

[請求項17]
 請求項1~16のいずれか一項に記載の方法で得られた細胞層。

[請求項18]
 請求項17に記載の細胞層を用いた、被検物質の脳血管関門透過性を評価する方法。

[請求項19]
 以下の工程(i)~(iii)を含む、請求項18に記載の方法:
 (i)請求項17に記載の細胞層を用意する工程;
 (ii)前記細胞層に被検物質を接触させる工程;
 (iii)前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の透過性を評価する工程。

[請求項20]
 請求項17に記載の細胞層を用いた、被検物質の脳血管関門バリア機能への影響を評価する方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NAGOYA CITY UNIVERSITY
  • Inventor
  • MATSUNAGA, Tamihide
  • HASHITA Tadahiro
  • YAMASHITA Misaki
IPC(International Patent Classification)
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