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METHOD FOR GLOMERULAR PODOCYTE INDUCTION, AND METHOD FOR PRODUCING PODOCYTE FROM PLURIPOTENT STEM CELL USING SAID INDUCTION METHOD

Foreign code F200010025
File No. (S2018-0663-N0),S2020-0084-N0
Posted date Jan 30, 2020
Country WIPO
International application number 2019JP021137
International publication number WO 2019230737
Date of international filing May 28, 2019
Date of international publication Dec 5, 2019
Priority data
  • P2018-102739 (May 29, 2018) JP
Title METHOD FOR GLOMERULAR PODOCYTE INDUCTION, AND METHOD FOR PRODUCING PODOCYTE FROM PLURIPOTENT STEM CELL USING SAID INDUCTION METHOD
Abstract The purpose of the present invention is to provide a method for inducing a glomerular podocytes in vitro. More specifically, the present invention provides a method for producing podocytes, whereby a cell population having a high composition ratio of podocytes can be obtained by selective induction of podocytes. Through the present invention, a method for induced podocyte differentiation is provided, the method including the following steps: step A: a step for culturing a nephron precursor cell or a population thereof in a medium including a Wnt agonist and a ROCK inhibitor; step B: a step for culturing a cell obtained in step A or a population thereof in a medium including Fgf; and step C: a step for culturing a cell obtained in step B or a population thereof in a medium including Fgf (here, the medium in step B and/or the medium in step C includes a TGFβ signal pathway inhibitor).
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Kidney glomerulus podocyte of the present, an important role in the filtration of blood are responsible for. Podocyte has proteinuria and failure, and then proceeds to the end-stage renal failure eventually needs a dialysis treatment, medical study podocyte important research theme to be a cost.
Podocyte studies, in vitro analysis of immortalized cell lines is used received (non-patent document 1). However, this cell lines gene or protein expression of podocyte characteristic of an extremely low level, carrying out the study problem that insufficient material (non-patent document 2) had. Human iPS cells to be selected from the past to induce podocyte and the reports, a specific gene of podocyte NPHS1 should be prior to induction of the expression level of human iPS cells from 1/10 to 1/5 as compared with the expression remains very low (non-patent document 3-5; Patent Document 1). Therefore, these cells may be induced in a report, referred to as insufficient quality of podocyte considered.
Including reports made by the present inventors, in recent years, human iPS cells from the nephron induced progenitor cells, kidney podocyte and tubule cells created in the test tube containing a plurality of research organoids have been reported (Non-Patent Document 6-9; Patent Document 2). A large number of cell types including renal organoids in the population, an experiment to reduce urinary protein podocyte fault model for drug screening for therapeutic drug development for, and a more refined podocyte of the cell (cell-autonomous) autonomous verification of the effect are required. Therefore, a high-purity podocyte efficiently from the cell population to induce the differentiation of a method of manufacturing or is demanded.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
 ポドサイトを分化誘導する方法であって、以下の工程:
工程A:ネフロン前駆細胞又はその集団を、Wntアゴニスト及びROCK阻害物質を含む培地で培養する工程、
工程B:工程Aで得られた細胞又はその集団を、Fgfを含む培地で培養する工程、及び、
工程C:工程Bで得られた細胞又はその集団を、Fgfを含む培地で培養する工程、
を含む方法、
ここで、工程B又は工程Cにおける培地の少なくとも一つは、TGFβシグナル経路阻害物質を含む。

[請求項2]
 工程Aで用いる培地のWntアゴニストの濃度が、1μMより多くかつ10μMより少ない、請求項1に記載の方法。

[請求項3]
 前記工程B及び工程Cにおける培地が、さらに約1μM以下の濃度のWntアゴニストを含む請求項1又は2に記載の方法。

[請求項4]
 前記工程Aにおける培養が、12時間~48時間であり、かつ前記工程Bにおける培養が12時間~48時間である、請求項1~3のいずれか一つに記載の方法。

[請求項5]
 前記工程Cにおける培養が、2~30日である、請求項4に記載の方法。

[請求項6]
 前記WntアゴニストがCHIR99021であり、前記TGFβシグナル経路阻害物質がSB431542である、請求項1~5のいずれか一つに記載の方法。

[請求項7]
 前記ネフロン前駆細胞が哺乳動物由来のiPS細胞から誘導されたネフロン前駆細胞である、請求項1~6のいずれか一つに記載の方法。

[請求項8]
 前記iPS細胞が、ヒト由来のiPS細胞である請求項7に記載の方法。

[請求項9]
 前記工程B及び/又は工程Cにおける培地が、さらに、Wntシグナル阻害物質を含む、請求項7又は8に記載の方法。

[請求項10]
 前記工程B及び/又は工程Cにおける培地が、さらに、レチノイン酸(RA)又はRAアナログを含む、請求項7~9のいずれか一つに記載の方法。

[請求項11]
 前記ネフロン前駆細胞が、以下の工程:
(a)ヒトiPS細胞から誘導された胚様体を、高濃度(濃度A)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、
(b)前記胚様体を、Bmp、アクチビン、レチノイン酸、及び中濃度(濃度B)のWntアゴニスト、を含有する培地で培養する工程、及び
(c)前記胚様体を、Fgf、及び低濃度(濃度C)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、
をその順で含む分化誘導工程(ここで、Wntアゴニストの濃度は、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である。)、
によりヒトiPS細胞から誘導される、請求項7~10のいずれか一つに記載の方法。

[請求項12]
 前記工程(a)、(b)及び(c)におけるWntアゴニストがCHIR99021であって、前記濃度A及び濃度Cが、それぞれ、7.5μM~15μM、0.5μM~2.0μMであり、かつ、前記工程(b)におけるBmpがBmp4であって、培地における濃度が1ng/ml~10ng/mlであり、かつ、前記工程(b)の培地におけるアクチビンの濃度が、2.5~40ng/mLの濃度である、請求項11に記載の方法。

[請求項13]
 ポドサイトを分化誘導するための培地キットであって、該キットは、分化誘導培地、及び、以下に記載のそれぞれの成分を含む3つの容器を含む培地キット、
(1)Wntアゴニスト及びROCK阻害物質を含む第一の容器、
(2)TGFβシグナル経路阻害物質、Wntシグナル阻害物質、レチノイン酸(RA)又はRAアナログ、及びFgfを含む第二の容器、及び
(3)TGFβシグナル経路阻害物質、Wntシグナル阻害物質、レチノイン酸(RA)又はRAアナログ、及びFgfを含む第三の容器。

[請求項14]
 前記容器(2)及び(3)が、さらに、Wntアゴニスト、を含む請求項13に記載の培地キット。

[請求項15]
 ポドサイトの細胞集団を製造する方法であって、以下の工程:
(i)哺乳動物由来のiPS細胞又はその集団からネフロン前駆細胞又はその集団を分化誘導する工程、
(ii)工程(i)で得られたネフロン前駆細胞又はその集団を、Wntアゴニスト及びROCK阻害物質、を含む培地で培養する工程、
(iii)工程(ii)で得られた細胞又はその集団を、Fgfを含む培地で培養する工程、及び、
(iv)工程(iii)で得られた細胞又はその集団を、Fgfを含む培地で培養する工程、
を含む方法、
ここで、工程(iii)又は工程(iv)における培地の少なくとも一つはTGFβシグナル経路阻害物質含み、工程(iii)又は工程(iv)における培地の少なくとも一つはWntシグナル阻害物質を含み、かつ工程(iii)又は工程(iv)における培地の少なくとも一つはレチノイン酸(RA)又はRAアナログを含む。

[請求項16]
 前記工程(ii)で用いる培地のWntアゴニストの濃度が、1μMより多くかつ10μMより少ない、請求項15に記載の方法。

[請求項17]
 前記工程(iii)及び(iv)における培地が、さらに約1μM以下の濃度のWntアゴニストを含む請求項15又は16に記載の方法。

[請求項18]
 前記iPS細胞が、ヒト由来のiPS細胞である請求項15~17のいずれか一つに記載の方法。

[請求項19]
 前記工程(ii)における培養が、12時間~48時間であり、かつ前記工程(iii)における培養が12時間~48時間である、請求項15~18のいずれか一つに記載の方法。

[請求項20]
 前記工程(iv)における培養が、2~30日である、請求項17に記載の方法。

[請求項21]
 前記WntアゴニストがCHIR99021であり、前記TGFβシグナル経路阻害物質がSB431542であり、前記Wntシグナル阻害物質がIWR-1である、請求項15~18のいずれか一つに記載の方法。

[請求項22]
 前記工程(i)が、以下の工程:
(a)ヒトiPS細胞から誘導された胚様体を、高濃度(濃度A)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、
(b)前記胚様体を、Bmp、アクチビン、レチノイン酸、及び中濃度(濃度B)のWntアゴニスト、を含有する培地で培養する工程、及び
(c)前記胚様体を、Fgf、及び低濃度(濃度C)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、
をその順で含む分化誘導工程(ここで、Wntアゴニストの濃度は、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である。)、
である、請求項15~21のいずれか一つに記載の方法。

[請求項23]
 前記工程(a)、(b)及び(c)におけるWntアゴニストがCHIR99021であって、前記濃度A及び濃度Cが、それぞれ、7.5μM~15μM、0.5μM~2.0μMであり、かつ、前記工程(b)におけるBmpがBmp4であって、培地における濃度が1ng/ml~10ng/mlであり、かつ、前記工程(b)の培地におけるアクチビンの濃度が、2.5ng/mL~40ng/mLの濃度である、請求項20に記載の方法。

[請求項24]
 試験物質のポドサイトに対する影響又は効果を評価する方法であって、該試験物質の存在下で、請求項1~12、15~23のいずれか一つに記載の方法で作製したポドサイトの細胞集団を培養し、該細胞に関する以下の項目:細胞の増殖、細胞の生存、細胞の障害、タンパク質発現量、遺伝子発現量、アルブミン取り込み能、アルブミンろ過能、オートファジー活性及び細胞内伝達シグナルからなる群から選ばれる少なくとも一つの項目を測定し、該試験物質のポドサイトに対する影響を評価することを含む方法。

[請求項25]
 ポドサイト障害を治療又は回復させる物質をスクリーニングする方法であって、(x)請求項1~12、15~23のいずれか一つに記載の方法で作製したポドサイトの細胞集団を、ポドサイト障害性を示す薬剤及び試験物質の存在下で培養する工程と、(y)ポドサイト細胞の生存、増殖、障害の軽減、タンパク質発現量の変化、及び遺伝子発現量の変化からなる群から選ばれる少なくとも一つの項目を測定する工程、とを含むポドサイト障害を治療又は回復させる候補物質をスクリーニングする方法、
ここで、工程(x)におけるポドサイト細胞集団の培養は、以下のいずれでもよい:
(x-1)ポドサイト障害性を示す薬剤及び試験物質が同時に存在する環境下でポドサイト細胞集団を培養する、又は
(x-1)ポドサイト障害性を示す薬剤の存在下でポドサイト細胞集団を培養し、次いで、試験物質の存在下で該障害ポドサイト細胞集団を培養する。

[請求項26]
 前記ポドサイト障害性を示す薬剤がピューロマイシンアミノヌクレオシド、ドキソルビシン、アンジオテンシンII、及び抗ポドサイト抗体からなる群より選ばれる少なくとも一つの薬剤である請求項25に記載のスクリーニング方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KUMAMOTO UNIVERSITY
  • Inventor
  • NISHINAKAMURA Ryuichi
  • TAGUCHI Atsuhiro
  • YOSHIMURA Yasuhiro
IPC(International Patent Classification)
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