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METHOD FOR SYNTHESIZING ENZYME FOR β-GLYCOSIDE OF LACTO-N-BIOSE I OR GALACTO-N-BIOSE USING MODIFIED PHOSPHORYLASE meetings

Foreign code F200010049
File No. 6192
Posted date May 14, 2020
Country WIPO
International application number 2019JP032866
International publication number WO 2020040257
Date of international filing Aug 22, 2019
Date of international publication Feb 27, 2020
Priority data
  • P2018-157840 (Aug 24, 2018) JP
Title METHOD FOR SYNTHESIZING ENZYME FOR β-GLYCOSIDE OF LACTO-N-BIOSE I OR GALACTO-N-BIOSE USING MODIFIED PHOSPHORYLASE meetings
Abstract This application provides: a modified GLNBP protein in which a mutation is introduced to a certain region of a non-mutant GLNBP; and a method of forming a β-1,3 bond between the 1-position of a galactose-1-phosphate using the modified GLNBP, and the 3-position of an N-acetylglucosamine residue or an N-acetylgalactosamine residue in a saccharide having the N-acetylglucosamine residue or the N-acetylgalactosamine residue which is β-bound to a non-reducing end thereof, and also having one or multiple saccharide residues.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Milk nutrient infant intestinal flora is dominant bifidobacterium is formed, the human milk oligosaccharides which is included in the involved components. Among the oligosaccharide moieties, tetraose -N- lacto (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) was incubated with the true known factor. The formation of an infant intestinal flora, adult obesity after a large impact on the allergies known, WHO may recommend to the gnotobiotic breast milk, breast milk gnotobiotic been made are reduced, also to the premature timing of the weaning. Also, cesarean rate exceeds 25% all over the world, the infant intestinal flora the delivery is a vaginal birth of the infant can be significantly different from that known in the art. For this reason, close to human milk to milk prepared and the urgent need for the development. However, the existing -N- lacto tetraose as a synthesis method using chemical synthesis and metabolic engineering (for example non-patent document 1) fermentation methods have been developed however, has not been practical either.
Β-1, 3-N - galactosyl (EC 2.4.1.211 acetylhexosamine phosphorylase; a.k.a.: -N- galacto -N- lacto-biose biose/phosphorylase I) (hereinafter, sometimes abbreviated as GLNBP) is, lacto-biose I - N-1-phosphate (Galβ1-3GlcNAc) galactose (Gal-1-P) (GlcNAc) and the N- acetylglucosamine, and galactose -N- galacto-biose-1-phosphate (Galβ1-3GalNAc) (Gal-1-P) (GalNAc) and the N- acetylgalactosamine, and its reverse reaction of the decomposition pressure of phosphoric acid having a catalytic activity is known as an enzyme, its presence is Bifidobacterium many bacteria Rhoma widely been found. However, such as - N-N - lacto-biose tetraose GLNBP is β - glycoside of lacto-I do not act, using its reverse reaction of these compounds may not be prepared.
GLNBP the structure of much research has been made. For example the following may be referred to as lines and Bifidobacterium longum subsp. longum (strain ATCC 15707/DSM 20219/JCM 1217/NCTC 11818/E194b) (, Bifidobacterium longum JCM1217) in the result and from the storage stability, Bifidobacterium sp 27 in the helix of the structure has been suggested (Non-Patent Document 2). The three-dimensional structure 3 in the center of activity than have been reported the results of a study (for example Non-Patent Document 3).
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
 非変異型GLNBPのアミノ酸配列を配列番号1に示すアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1における452~467位に対応する位置の領域において、1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および/または挿入されており;および
 ガラクトース-1-リン酸の1位と、非還元末端にβ結合したN-アセチルグルコサミン残基またはβ結合したN-アセチルガラクトサミン残基を有しかつ1または複数個の糖残基を有する糖における該N-アセチルグルコサミン残基またはN-アセチルガラクトサミン残基の3位とをβ-1,3結合させる酵素活性を有する、改変GLNBPタンパク質。

[請求項2]
 非変異型GLNBPの活性中心の三次元的近傍に位置するループ領域において、1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および/または挿入されており;および
 ガラクトース-1-リン酸の1位と、非還元末端にβ結合したN-アセチルグルコサミン残基またはβ結合したN-アセチルガラクトサミン残基を有しかつ1または複数個の糖残基を有する糖における該N-アセチルグルコサミン残基またはN-アセチルガラクトサミン残基の3位とをβ-1,3結合させる酵素活性を有する、改変GLNBPタンパク質。

[請求項3]
 該非変異型GLNBPの活性中心の三次元的近傍に位置するループ領域が、該非変異型GLNBPのアミノ酸配列を配列番号1に示すアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1における452~467位に対応する位置の領域である、請求項2に記載の改変GLNBPタンパク質。

[請求項4]
 該非還元末端にβ結合したN-アセチルグルコサミン残基またはβ結合したN-アセチルガラクトサミン残基を有しかつ1または複数個の糖残基を有する糖がラクト-N-トリオースIIであり、ラクト-N-テトラオースを合成する酵素活性を有する、請求項1~3のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質。

[請求項5]
 該非変異型GLNBPの活性中心の三次元的近傍に位置するループ領域において、1~16個のアミノ酸が欠失、1~16個のアミノ酸が1~16個のアミノ酸により置換、および/または1~10個のアミノ酸が挿入されている、請求項2~4のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質。

[請求項6]
 該非変異型GLNBPのアミノ酸配列を配列番号1に示すアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1における452~467位に対応する位置の領域において、1~16個のアミノ酸が欠失、1~16個のアミノ酸が1~16個のアミノ酸により置換、および/または1~10個のアミノ酸が挿入されている、請求項1~5のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質。

[請求項7]
 該非変異型GLNBPのアミノ酸配列を配列番号1に示すアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1における452~467位に対応する位置の領域において、連続する3~10個のアミノ酸が欠失しているか、または連続する3~10個のアミノ酸が少なくとも1つのグリシンを含む連続する2~10個のアミノ酸により置換されている、請求項1~6のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質。

[請求項8]
 該非変異型GLNBPのアミノ酸配列を配列番号1に示すアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1における452~467位に対応する位置の領域において、連続する3~10個のアミノ酸が連続する2~10個のグリシンにより置換されている、請求項1~7のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質。

[請求項9]
 該非変異型GLNBPのアミノ酸配列を配列番号1に示すアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1における452~467位に対応する位置の領域において、連続する3~10個のアミノ酸が、X 1X 2G、X 1GX 2、X 1GG、GX 1G、またはGGG(X 1およびX 2は同一または異なるグリシン以外のアミノ酸を示す)から選択される連続する3個のアミノ酸により置換されている、請求項1~7のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質。

[請求項10]
 該非変異型GLNBPのアミノ酸配列を配列番号1に示すアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1における452~467位のアミノ酸が、AGG、CGG、EGG、FGG、HGG、IGG、KGG、LGG、MGG、NGG、PGG、QGG、SGG、TGG、WGG、YGG、GPG、GGC、GGL、GGM、GGP、GGQ、GGS、GGY、MGL、MGS、LGL、およびLGSからなる群から選択される連続する3個のアミノ酸により置換されている、請求項1~7のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質。

[請求項11]
 該非変異型GLNBPが、Bifidobacterium属、Anaerococcus属、Clostridium属、Cutibacterium属、Erysipelothrix属、Lachnoclostridium属、Streptobacillus属、またはVibrio属由来である、請求項1~10のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質。

[請求項12]
 該非変異型GLNBPが、
(i)配列番号1~14および100から選択されるアミノ酸配列;または
(ii)配列番号1~14および100から選択されるアミノ酸配列と75%以上の配列同一性を有し、かつ、GLNBP活性を有する;
請求項1~11のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質。

[請求項13]
 以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1~12のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質:
(i)配列番号15~48、98および99から選択されるアミノ酸配列;
(ii)配列番号15~48、98および99から選択されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。

[請求項14]
 ガラクトース-1-リン酸の1位と、非還元末端にβ結合したN-アセチルグルコサミン残基を有しかつ1または複数個の糖残基を有する糖における該N-アセチルグルコサミン残基の3位とをβ-1,3結合させる酵素活性を有する、請求項1~13のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質。

[請求項15]
 請求項1~14のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

[請求項16]
 請求項15記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

[請求項17]
 請求項16記載のベクターで形質転換された宿主細胞。

[請求項18]
 請求項17記載の宿主細胞を培養し、該培養物から改変GLNBPタンパク質を回収することを含む、請求項1~14のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質の製造方法。

[請求項19]
 請求項1~14のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質の存在下に、ガラクトース-1-リン酸と非還元末端にβ結合したN-アセチルグルコサミン残基またはβ結合したN-アセチルガラクトサミン残基を有しかつ1または複数個の糖残基を有する糖とを反応させる工程を含む、該ガラクトース-1-リン酸の1位と該N-アセチルグルコサミン残基またはN-アセチルガラクトサミン残基の3位とをβ-1,3結合させる方法。

[請求項20]
 該非還元末端にβ結合したN-アセチルグルコサミン残基またはβ結合したN-アセチルガラクトサミン残基を有しかつ1または複数個の糖残基を有する糖がラクト-N-トリオースIIである、請求項19に記載の方法。

[請求項21]
 請求項1~14のいずれか1項に記載の改変GLNBPタンパク質の存在下に、ガラクトース-1-リン酸とラクト-N-トリオースIIとを反応させる工程を含む、ラクト-N-テトラオースを合成する方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • KYOTO UNIVERSITY
  • NATIONAL AGRICULTURE AND FOOD RESEARCH ORGANIZATION
  • Inventor
  • KATAYAMA, Takane
  • KATOH, Toshihiko
  • KITAOKA Motomitsu
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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