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METHOD FOR PRODUCING FOREIGN ANTIGEN RECEPTOR GENE-INTRODUCED CELL

Foreign code F200010054
File No. 6118
Posted date May 15, 2020
Country WIPO
International application number 2019JP029537
International publication number WO 2020022512
Date of international filing Jul 26, 2019
Date of international publication Jan 30, 2020
Priority data
  • P2018-140523 (Jul 26, 2018) JP
Title METHOD FOR PRODUCING FOREIGN ANTIGEN RECEPTOR GENE-INTRODUCED CELL
Abstract Provided are: a method for producing an antigen receptor gene-introduced cell, the method comprising a step for introducing a foreign T cell receptor (TCR) or chimeric antigen receptor (CAR) gene such that expression is accomplished under the control of a TCR expression controlling mechanism of a material cell; and a material cell for introducing a foreign antigen receptor gene having, on a TCR gene locus in the order of, from the upstream side, a promoter sequence in a V-region of the TCR gene locus, a drug-resistant gene or a reporter gene or a known TCR or CAR gene, and an enhancer sequence in a C-region of the TCR gene locus.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Disease-specific T cell receptor (TCR) or chimeric antigen receptor (CAR) of the mature T antigen receptor gene introduced into a cell which can be used for the treatment of a disease have been proposed. CAR-T cells introduced particular CAR treatment method has already been approved, has been in clinical use. T cells from a patient as a gene and a cell is used, a so-called self-implantation system. The introduction of the gene in the genome using lentivivus retrovirus or randomly introduced. Gene may be introduced by such methods, may damage the normal gene, such as a cancer gene and the risk of activation. Genome editing techniques while mature T reconstructed TCR loci of the cells in that the knocked CAR method reported in this paper (Nature, 543:113, 2017). In this way the physiological expression of the transgene is controlled so that the TCR, and thus more CAR-T cells produced is said to be high.
Different from the above approach, the inventors have found that the level of the pluripotent stem cells has been proposed a method of introducing the TCR (Patent Document 1). This is T from pluripotent stem cells and cells that is the strategy to be used by a cell-based therapies. CAR gene level of pluripotent stem cells in the TCR is also a method of introducing, by m. Sadelain has been proposed (Patent Document 2 and Non-Patent Document 1).
Until now, if the TCR CAR gene is a gene, gene loci T TCR of the cells other than a report that is not a knock. T cells other than the gene locus TCR reconstruction does not occur. TCR reconstruction of gene loci is not CAR TCR gene is knocked or is not to be reported.
, Recombinase-mediated Cassette Exchange(RMCE) method as the method of introducing the gene is known. This is on a gene of the cell such as a cassette deck in the particular portion of the sequence of foreign recombinant (cassette tape) into the structure in the target cell in advance, such as Cre Flippase and the recombinant enzyme introduced so as to exchange a cassette tape using a technique. T cell lines may be applied to a (non-patent document 2) in the document. However, this mechanism is introduced into the T cell gene loci that is not an example.
CAR TCR gene or genes, gene-introduced into the cells of the mature T general strategy. On the other hand, the inventors of the present invention a part of the TCR at the level of introducing a pluripotent stem cell has been proposed a method (JP-3-5). The method for introducing the gene for the CAR has been proposed. In such methods, when a gene is CAR and TCR, such as a random genome pmBCmCNluci introduced into the method that is employed. However, the original TCR and TCR gene knock CAR gene loci is the physiological expression pattern can be expected. In fact, already mature T cell re-configuration of the locus of the gene has been reported that CAR. TCR cells generally has a locus. However, T cells other than the gene locus TCR reconstruction does not occur. Thus T cells other than the material of the case of using the cell therapy, gene loci TCR simply by only introducing foreign TCR/CAR do not. Further, many types of TCR/CAR gene and is used for the expected, correct each knock on a required region of the time and cost it becomes a problem.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
材料細胞のT細胞受容体(TCR)発現制御機構の制御下で発現されるよう、外来TCRまたはCAR遺伝子を導入する工程を含む、抗原レセプター遺伝子が導入された細胞の製造方法。

[請求項2]
材料細胞が、T細胞受容体の再構成が生じていない細胞である、請求項1記載の方法。

[請求項3]
材料細胞が、多能性幹細胞である、請求項1または2記載の方法。

[請求項4]
外来TCRまたはCAR遺伝子の導入を、Recombinase-mediated Cassette Exchange(RMCE)法あるいはゲノム編集法にて行う、請求項1~3いずれかに記載の方法。

[請求項5]
材料細胞ゲノムのTCR遺伝子座に、上流から順にTCR遺伝子座V領域のプロモーター配列、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知TCRまたはCAR遺伝子、TCR遺伝子座C領域のエンハンサー配列を有する、外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞。

[請求項6]
TCR遺伝子座V領域のプロモーター配列と、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知TCRまたはCAR遺伝子の間に、組換え酵素の標的配列(i)を有し、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは外来TCRまたはCAR遺伝子とTCR遺伝子座C領域のエンハンサー配列の間に組換え酵素の標的配列(ii)を有する、請求項5記載の外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞。

[請求項7]
既知TCRまたはCAR遺伝子を有している、請求項5または6記載の外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞。

[請求項8]
材料細胞ゲノムのTCR遺伝子座に、上流から順にTCR遺伝子座V領域のプロモーター配列、第1の組換え酵素の標的配列(i)、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター下で発現するよう連結された第1の薬剤耐性遺伝子、第1の組換え酵素の標的配列(ii)、第2の薬剤耐性遺伝子、第2の組換え酵素の標的配列、およびTCR遺伝子座C領域のエンハンサー配列を有する、外来の抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞。

[請求項9]
材料細胞ゲノムTCR遺伝子座が、材料細胞TCRα鎖またはβ鎖である請求項5~8いずれかに記載の材料細胞。

[請求項10]
材料細胞ゲノムTCR遺伝子座において、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは外来TCRまたはCAR遺伝子が導入されている遺伝子座以外のTCRα鎖およびTCRβ鎖が欠損されている、請求項9記載の材料細胞。

[請求項11]
材料細胞が多能性幹細胞である、請求項5~10いずれかに記載の材料細胞。

[請求項12]
(a)上流から順に、第1の組換え酵素の標的配列(i)、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第1の薬剤耐性遺伝子、(i)と相違する第1の組換え酵素の標的配列(ii)、第2の薬剤耐性遺伝子、および第2の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを準備する工程、
(b)材料細胞ゲノムのTCR遺伝子座へ(a)で準備したベクターをノックインする工程、
(c)(b)で得られた細胞を第1の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程、を含む、請求項8~11いずれかに記載の材料細胞の製造方法。

[請求項13]
工程(b)において、材料細胞の再構成されていないTCR遺伝子座の1のV領域プロモーター配列の下流に、当該V領域プロモーター配列より下流にあるV領域とDJ領域と置換するよう(a)で準備したベクターをノックインする、請求項12記載の方法。

[請求項14]
工程(a)のベクターが、さらにTCR遺伝子座V領域のプロモーター配列を最上流に有しており、工程(b)において、当該ベクターを材料細胞ゲノムTCR遺伝子座のDJ領域にノックインする、請求項12記載の方法。

[請求項15]
工程(a)のベクターが、さらにTCR遺伝子座C領域のエンハンサー配列を最下流に有しており、工程(b)において、当該ベクターを材料細胞ゲノムTCR遺伝子座のV領域にノックインする、請求項12記載の方法。

[請求項16]
(A)請求項8に記載の材料細胞を準備する工程、
(B)上流から順に第1の組換え酵素の標的配列(i)、外来のTCRまたはCAR遺伝子、第2の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第1の組換え酵素の標的配列(ii)を含む、TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
(C)TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを該材料細胞へ導入し、同時に第1の組換え酵素を作用させることによって、TCRまたはCAR遺伝子カセットベクターの第1の組換え酵素の標的配列(i)(ii)に挟まれる配列、と交換する工程、
(D)第2の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤にて、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
(E)第2の組換え酵素を(D)で選択された細胞に作用させて、第2の組換え酵素の標的配列で挟まれる第2の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程
を含む、外来抗原レセプター遺伝子が導入された細胞の製造方法。

[請求項17]
(1)上流から順に、TCR遺伝子座V領域のプロモーター配列、および第1の組換え酵素の標的配列(i)、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第1の薬剤耐性遺伝子、(i)と相違する第1の組換え酵素の標的配列(ii)、第2の薬剤耐性遺伝子、および第2の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを準備する工程、
(2)材料細胞ゲノムのTCR遺伝子座へ(1)のベクターをノックインする工程、
(3)(2)で得られた細胞を第1の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程、
(4)上流から順に第1の組換え酵素の標的配列(i)、外来のTCRまたはCAR遺伝子、第2の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第1の組換え酵素の標的配列(ii)を含む、TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
(5)TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを(3)で選択された薬剤耐性カセットがノックインされた材料細胞へ導入し、同時に第1の組換え酵素を作用させることによって、TCRまたはCAR遺伝子カセットベクターの第1の組換え酵素の標的配列(i)(ii)に挟まれる配列と交換する工程、
(6)第2の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤にて、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
(7)第2の組換え酵素を(6)で選択された細胞に作用させて、第2の組換え酵素の標的配列で挟まれる第2の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程
を含む、外来の抗原レセプター遺伝子を導入した細胞の製造方法。

[請求項18]
外来のTCRまたはCAR遺伝子が、再構成済TCR遺伝子である、請求項16または17記載の方法。

[請求項19]
外来のTCR遺伝子が、再構成済TCRα鎖およびTCRβ鎖の両方を含む、請求項18記載の方法。

[請求項20]
請求項16~18いずれかに記載の方法にて外来のTCRまたはCAR遺伝子が導入された細胞を得、得られた細胞をT細胞へと分化誘導する工程を含む、細胞療法用細胞の製造方法。

[請求項21]
請求項5~7いずれかに記載の外来の抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞をT前駆細胞またはT細胞へと分化誘導する工程、外来のTCRまたはCAR遺伝子を、ゲノム編集法あるいはRecombinase-mediated Cassette Exchange(RMCE)法にて該誘導されたT前駆細胞またはT細胞のゲノムTCR遺伝子座のV領域のプロモーター配列とC領域のエンハンサー配列の間に導入する工程を含む、細胞療法用細胞の製造方法。

[請求項22]
請求項7に記載の外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞をT前駆細胞またはT細胞へと分化誘導する工程、ゲノム編集法あるいはRecombinase-mediated Cassette Exchange(RMCE)法にて該誘導されたT前駆細胞またはT細胞の既知TCRまたはCAR遺伝子を外来TCRまたはCAR遺伝子と入れ替える工程、および既知のTCRまたはCAR遺伝子に特異的な抗体またはテトラマーを用いて外来TCRまたはCAR遺伝子との入れ替えに成功していない細胞を除く工程を含む、細胞療法用細胞の製造方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • KYOTO UNIVERSITY
  • SHIGA UNIVERSITY OF MEDICAL SCIENCE
  • Inventor
  • KAWAMOTO, Hiroshi
  • AGATA, Yasutoshi
  • NAGANO, Seiji
  • TERADA, Koji
  • MASUDA, Kyoko
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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