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DEVELOPMENT OF NOVEL TECHNIQUE BASED ON CHEMICAL CROSSLINKING FOR VISUALIZATION OF IN-VIVO RECEPTORS

Foreign code F200010062
File No. 6060
Posted date May 15, 2020
Country WIPO
International application number 2019JP007942
International publication number WO 2019168125
Date of international filing Feb 28, 2019
Date of international publication Sep 6, 2019
Priority data
  • P2018-036827 (Mar 1, 2018) JP
Title DEVELOPMENT OF NOVEL TECHNIQUE BASED ON CHEMICAL CROSSLINKING FOR VISUALIZATION OF IN-VIVO RECEPTORS
Abstract The present disclosure provides a labeling method for biological samples, the method comprising: (a) a step in which an immobilizing agent is applied to a cell-containing biological sample; and (b) a step in which a labeling reagent is applied to the cell-containing biological sample (either one among step (a) or step (b) can be performed first, or step (a) and step (b) can be performed simultaneously). The labeling reagent contains: a ligand for a cell surface receptor; a labeling substance; and at least one reactive group that reacts with the immobilizing agent. Some of the cells contained in the cell-containing biological sample include said cell surface receptor. The cell surface receptor comprises a ligand binding site and at least one reactive group that reacts with the immobilizing agent. The immobilizing agent reacts with the reactive group of the labeling reagent and the reactive group of the cell surface receptor to form a covalent bond, whereby the labeling reagent and the cell surface receptor are connected to each other.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Cell surface receptors, cell recognition, signal transduction, material transport into and out of the cells, is important as points of action of the drug, hydrophobic proteins embedded in the cell membrane is difficult for separated and purified, labeled antibodies to cell surface receptors can be performed.
Exposed on the surface of a biological sample of cells in the case of labeling, the labeling of cells with antibodies is possible, if the thickness of a layer of cells, such as an antibody and a large molecule is difficult to penetrate to the deep portion, the deep portion of the label can be difficult.
Patent Document 1 is, with respect to neurotransmitter receptors labeled ligand a compound having a labeled neurotransmitter receptor by the technique is disclosed, wherein the compound is used as the stability of the compound is labeled, a deep portion of the entire tissue there is room for improvement in terms of the label.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
生体サンプルのラベル化方法であって、当該方法は、
 (a)細胞含有生体サンプルに固定化剤を適用する工程、および
 (b)前記細胞含有生体サンプルにラベル化剤を適用する工程、
を含み、
 ここで、
 工程(a)と工程(b)は、いずれを先に行ってもよく、工程(a)と工程(b)を同時に行ってもよく、
 前記ラベル化剤は、細胞表面受容体に対するリガンド、標識物質及び固定化剤と反応する少なくとも1種の反応性基を有し、
 前記細胞含有生体サンプルに含まれる一部の細胞は、前記細胞表面受容体を含み、
 前記細胞表面受容体は、前記固定化剤と反応する少なくとも1種の反応性基とリガンド結合部位を有し、
 前記固定化剤は、前記ラベル化剤の反応性基及び前記細胞表面受容体の反応性基と反応して共有結合を形成し、それにより前記ラベル化剤と前記細胞表面受容体を連結する、生体サンプルのラベル化方法。

[請求項2]
前記固定化剤との共有結合に関与するラベル化剤の反応性基の数と前記細胞表面受容体の反応性基の数は同じである、請求項1に記載の生体サンプルのラベル化方法。

[請求項3]
前記細胞表面受容体の反応性基が、NH 2、OH及びSHからなる群から選ばれ、前記ラベル化剤の反応性基が、NH 2、NHNH 2、CONHNH 2、OH及びSHからなる群から選ばれる、請求項1~2のいずれか1項に記載の生体サンプルのラベル化方法。

[請求項4]
前記工程(a)が、前記工程(b)と同時に行なわれる、請求項1~3のいずれか1項に記載の生体サンプルのラベル化方法。

[請求項5]
前記固定化剤で予め固定された細胞含有生体サンプルを提供すること、または、当該固定化剤で予め固定された細胞含有生体サンプルとともに前記固定化剤をさらに共存させることのいずれかによって、前記工程(a)が達成され、
前記工程(b)において、前記固定化剤で固定された生体サンプルと前記ラベル化剤が反応する、請求項1~4のいずれか1項に記載の生体サンプルのラベル化方法。

[請求項6]
前記細胞表面受容体の反応性基、前記ラベル化剤の反応性基と前記固定化剤の反応が、可逆的である、請求項1~5のいずれか1項に記載の生体サンプルのラベル化方法。

[請求項7]
細胞表面受容体が、神経伝達物質の受容体である、請求項1~6のいずれか1項に記載の生体サンプルのラベル化方法。

[請求項8]
前記固定化剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、メチルグリオキサール及びスベリイミド酸ジメチルからなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項1~7のいずれか1項に記載の生体サンプルのラベル化方法。

[請求項9]
前記細胞含有生体サンプルが、脳、心臓、肝臓、胆嚢、腎臓、副腎、膵臓、肺、甲状腺、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、尿管、膀胱、前立腺、子宮、乳房、気管支、血管、リンパ管、皮膚、骨、関節、筋肉、口腔粘膜、鼻粘膜からなる群から選ばれる少なくとも1種を含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の生体サンプルのラベル化方法。

[請求項10]
ラベル化剤でラベル化された細胞含有生体サンプルであって、前記ラベル化剤は、生体サンプルの細胞表面受容体と固定化剤により共有結合で連結されている、ラベル化された細胞含有生体サンプル。

[請求項11]
細胞表面受容体に対するリガンド、標識物質及び固定化剤と反応する少なくとも1種の反応性基を有し、前記固定化剤により細胞含有生体サンプルの細胞表面受容体と連結するために使用される、ラベル化剤。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • KYOTO UNIVERSITY
  • Inventor
  • HAMACHI, Itaru
  • KIYONAKA, Shigeki
  • AMAIKE, Kazuma
  • YAMAGAMI, Sadatoshi
  • NISHIKAWA, Yuki
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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