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PEPTIDE FOR CYTOSOLIC DELIVERY

Foreign code F200010092
File No. 5685
Posted date May 15, 2020
Country WIPO
International application number 2018JP011406
International publication number WO 2018174158
Date of international filing Mar 22, 2018
Date of international publication Sep 27, 2018
Priority data
  • P2017-055508 (Mar 22, 2017) JP
Title PEPTIDE FOR CYTOSOLIC DELIVERY
Abstract The present invention provides a peptide represented by formula (I): R1-IWLTALX5FLGX6X1AAX7X2X3AX8QX4LSX9L-R2 (wherein X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, R1 and R2 are as defined in the description).
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Protein, a nucleic acid into cells of the introduction of the raw measurement of cellular function, analysis and regulation of cell function is a very useful approach. For example, the current, the fusion fluorescent protein, a variety of intracellular protein localization or behavior has been observed. However, by the fusion fluorescent protein subcellular localization and the influence of the influence on the behavior or activity of a protein cannot be discarded, further, to control the amount of intracellular expression of the fusion protein is difficult. Therefore, these tight in the evaluation, it is desirable that the verification methods. Fusion fluorescent protein fluorescence characteristics and constraints, a suitable chemical fluorophore labeled protein can be introduced into the cell contributes to solve this problem. In addition, in recent years, the use of the native protein to recognize a variety of biosensor and have been developed (Non-Patent Document 1), the measurement cell is expected to be applied to. However, such a chemically modified protein is to be introduced into the cell from outside the cell at a time, in addition to the considerable amount of the protein from the outside of the cell is held in the endosome, the discharge to the cytoplasm, in order to prevent diffusion, these proteins within cells of the visualization and measurement of the desired function is often not possible.
On the other hand, in recent years, a variety of bio-polymer the development of a drug has been in rapid progress. Among these antibodies having specificity for the target is very high, a low-molecular pharmaceutical to the target molecule as an alternative has been the development of the world. However, typically does not transition within the cytoplasm of antibodies, cell membrane receptors on the target or extracellular disease-related factors in the current is limited. Cytoskeletal associated proteins in the cytoplasm and, associated with various factors such as the target for the treatment of disease activity and can be in many cases. Therefore, the efficiency of the polymer in the cell if the introduction is established, the application range of the pharmaceutical antibody greatly enlarged. SiRNA nucleic acid (DNA, RNA) such as further, also in the cells of the target substance is introduced into the pharmaceutical.
As described above, including biologically active protein antibody, nucleic acid, pharmaceutical raw into the cytoplasm of the establishment of a method for effective introduction is demanded.
Endosome cytoplasmic protein or a drug included in the typical discharge unstable peptide as endosome, GALA (non-patent document 2), influenza, the peptide from the protein hemagglutinin (Non-Patent Document 3) HA2 and the like. These are, pH-dependent membrane fusion peptides, and about 5 in pH endosome of the fuzed film formability, which damage the endosomal membrane, cytoplasmic inclusions are released. In addition, known as transmembrane peptide HA2 and peptide HIV-1 Tat peptide (non-patent document 4) as well as the connecting body has been reported, such as Cre and biologically active protein Tat fusion protein used in the cells of the introduced has been reported an example.
In addition, a film having a honeycomb melittin Anuroctoxin in cytotoxicity, basic amino acids lysine maleic acid derivative protected by a pH sensitivity, pH endosome in the desorption of the protecting groups are removed by reduction, to selectively damage the endosomal membrane, cytoplasmic inclusions endosomolysis attempt is released to have been reported (Non-Patent Document 5).
Further, a polycationic polymer such as polyethylene imine proton of the degree of the decrease in the pH rises, induces swelling of the endosome, contents (such as nucleic acid) released into the cytoplasm of the reported (proton sponge effect: Non-Patent Document 6). The pH-sensitive polymer is introduced into the various gene (Patent Document 1) are used.
Patent Document 2 is, including an antibody protein can be introduced into living cells are peptides, the transfer efficiency was room for improvement.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
下記式(I):
R 1-IWLTALX 5FLGX 6X 1AAX 7X 2X 3AX 8QX 4LSX 9L-R 2   (I)
(式中、X 1及びX 2は、同一又は異なってH又はAを示す。X 3はE、L-2-aminoadipic acid (Aad) 、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。X 4はQ、L-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸、2-アミノスベリン酸又はEを示す。X 5~X 9は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
但しX 1=H、X 2=H、X 3=E 、X 4=Q、かつ、X 5~X 9=Kの場合を除く、並びに、
X 4=E、かつ、X 5~X 9=Kのとき、X 1とX 2の一方または両方がAである。 R 1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。R 2は水酸基(OH)、アミノ基(NH 2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。)
で表されるペプチド。

[請求項2]
下記の(Ia)~(Ie)のいずれかで表される請求項1に記載のペプチド。
R 1-IWLTALX 5FLGX 6AAAX 7AEAX 8QELSX 9L-R 2 (Ia)
R 1-IWLTALX 5FLGX 6HAAX 7HXAX 8QQLSX 9L-R 2 (Ib)
R 1-IWLTALX 5FLGX 6AAAX 7AXAX 8QXLSX 9L-R 2  (Ic)
R 1-IWLTALX 5FLGX 6AAAX 7AEAX 8QQLSX 9L-R 2 (Id)
R 1-IWLTALX 5FLGX 6HAAX 7HXAX 8QXLSX 9L-R 2 (Ie)
(XはL-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示し、R 1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基又は目的物質を示す。R 2は水酸基(OH)、アミノ基(NH 2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。X 5~X 9は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。)

[請求項3]
下記の(Ia)~(Ic)のいずれかで表される請求項2に記載のペプチド。
R 1-IWLTALX 5FLGX 6AAAX 7AEAX 8QELSX 9L-R 2 (Ia)
R 1-IWLTALX 5FLGX 6HAAX 7HXAX 8QQLSX 9L-R 2 (Ib)
R 1-IWLTALX 5FLGX 6AAAX 7AXAX 8QXLSX 9L-R 2  (Ic)
(XはL-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示し、R 1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基又は目的物質を示す。R 2は水酸基(OH)、アミノ基(NH 2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。X 5~X 9は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。)

[請求項4]
請求項1~3のいずれか1項に記載のペプチドからなる細胞質送達剤。

[請求項5]
請求項1~3のいずれか1項に記載のペプチドをベクターに含む、細胞質を標的とする物質導入剤。

[請求項6]
請求項1~3のいずれか1項に記載のペプチドと目的物質が直接あるいはスペーサーを介して共有結合されてなる、細胞質を標的とする物質導入剤。

[請求項7]
請求項1~3のいずれか1項に記載のペプチドと目的物質が直接、あるいは目的物質と相互作用する他分子を介して非共有結合的な複合体を形成してなる、細胞質を標的とする物質導入剤。

[請求項8]
目的物質をベクターに内包する、請求項5に記載の細胞質を標的とする物質導入剤。

[請求項9]
前記ペプチドがベクターの構成成分に直接又はスペーサーを介して結合されている、請求項5に記載の物質導入剤。

[請求項10]
前記ペプチドと前記ペプチドの標的細胞へ親和性を高める分子とのコンジュゲートを含む、請求項4,5,6又は7に記載の物質導入剤。

[請求項11]
前記ペプチドが目的物質とともにベクターに内包されている、請求項5、8又は9に記載の物質導入剤。

[請求項12]
前記ベクターが、リポソーム、リピッドマイクロスフェア、高分子ミセル、高分子中空キャリア、ナノゲル、高密度リポタンパク質(HDL)、合成ポリマー、自己集合型核酸由来ベクター、ウイルス外殻タンパク質由来ベクター又はナノ粒子である、請求項5、8又は9に記載の物質導入剤。

[請求項13]
ベクターの構成成分がコレステロールあるいはリン脂質であり、前記ベクターがコレステロールあるいはリン脂質と請求項1~3のいずれか1項に記載のペプチドを含む複合体を含む、請求項9に記載の物質導入剤。

[請求項14]
下記式(IA)
R 1-(IWLTALX 5FLGX 6X 1AAX 7X 2X 3AX 8QX 4LSX 9L-Y) n-R 2 (IA)
(式中、X 1及びX 2は、同一又は異なってH又はAを示す。X 3はE、L-2-aminoadipic acid (Aad) 、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。X 4はQ、L-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸、2-アミノスベリン酸又はEを示す。X 5~X 9は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
但しX 1=H、X 2=H、X 3=E 、X 4=Q、かつ、X 5~X 9=Kの場合を除く、並びに、
X 4=E、かつ、X 5~X 9=Kのとき、X 1とX 2の一方または両方がAである。 R 1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。R 2は水酸基(OH)、アミノ基(NH 2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Yは単結合またはスペーサーを示す。nは2,3,4,5,6,7,8,9または10である。)
で表されるペプチド。

[請求項15]
下記式(IB):
 Z-(R am   (IB)
(式中、Zは分岐型の多価リンカーを示し、R aは、同一または異なって、R 1-IWLTALX 5FLGX 6X 1AAX 7X 2X 3AX 8QX 4LSX 9L-Y-を示すか、Y-IWLTALX 5FLGX 6X 1AAX 7X 2X 3AX 8QX 4LSX 9L-R 2を示す。X 1及びX 2は、同一又は異なってH又はAを示す。X 3はE、L-2-aminoadipic acid (Aad) 、2-アミノピメリン酸又は2-アミノスベリン酸を示す。X 4はQ、L-2-aminoadipic acid (Aad)、2-アミノピメリン酸、2-アミノスベリン酸又はEを示す。X 5~X 9は、同一又は異なって、Lys(K)、Arg(R)、ホモアルギニン、オルニチン、ホモリジン又は2-amino-7-guanidinoheptanoic acidを示す。
但しX 1=H、X 2=H、X 3=E、X 4=Q、かつ、X 5~X 9=Kの場合を除く、並びに、
X 4=E、かつ、X 5~X 9=Kのとき、X 1とX 2の一方または両方がAである。 R 1は水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。R 2は水酸基(OH)、アミノ基(NH 2)、モノアルキルアミノ基、モノアリールアミノ基、モノシクロアルキルアミノ、ジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基又は目的物質を示す。Yは単結合またはスペーサーを示す。mは2~8の整数である。)
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • KYOTO UNIVERSITY
  • Inventor
  • FUTAKI, Shiroh
  • SAKAMOTO, Kentarou
  • AKISHIBA, Misao
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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