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METHOD FOR INDUCING DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELL INTO CARDIAC MUSCLE

Foreign code F200010106
File No. 3494
Posted date May 18, 2020
Country WIPO
International application number 2013JP051644
International publication number WO 2013111875
Date of international filing Jan 25, 2013
Date of international publication Aug 1, 2013
Priority data
  • 201261591805 (Jan 27, 2012) US
Title METHOD FOR INDUCING DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELL INTO CARDIAC MUSCLE
Abstract The present invention relates to a method for inducing the differentiation of a pluripotent stem cell into a cardiac muscle, comprising the following steps: (1) a step of culturing the pluripotent stem cell in a culture medium containing at least one WNT signal activator; and (2) a step of culturing a cell produced in step (1) in a culture medium containing at least one WNT signal inhibitor.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Human pluripotent stem cells (hPSC) (human embryonic stem cell (hESC) and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) including) is, grow indefinitely in an undifferentiated state, with the heart to differentiate into many cell types of human tissues can be (non-patent document 1-7). Therefore, hPSC is, in the treatment of heart disease which can be useful for cell-based. Cell-based treatment, functions of the myocardial cells hPSC efficient production is required. The most common currently used method, cytokine of embryoid bodies (for example, DKK1, bFGF, Activin A, and BMP4) and the suspension culture, or mouse END2 (the proximal endoderm-like cells (visceral endoderm) ) co-culture is the removal of the (non-patent document 13,15-17). However, these methods have low efficiencies (production of heart muscle cells 10-50%) (non-patent document 15), animal cells or fetal bovine serum (FBS) in order to use the contamination cannot be avoided and the heterologous component (non-patent document 18), the, the use of recombinant cytokines is cost-effective for large-scale production is not good. Further, by previous studies, induction of heart muscle cells hPSC strains for optimal cytokine concentration is shown to be different from the individual (non-patent document 19) and, this is the optimization of the method indicates if operation is needed. Recently, universal hPSC lines does not depend on the cardiac muscle differentiation method were reported, the method for efficient differentiation FBS and growth factors such as bFGF or BMP4 (non-patent document 20) in need thereof.
Is a low molecular weight compound, unknown factors in the recombinant cytokine or FBS is a strong candidate as an alternative to the (non-patent document 21) and, for the large-scale culture are suitable for creating a chemically defined medium. So far, such as TGF-β WNT signal and signal activates or inhibits the signal transduction pathway (non-patent document 22, 23) for, or in place of the transcription factor to regulate expression of the (non-patent document 24, 25), a low-molecular compound is used. A plurality of small molecule compound, or tested for the promotion of differentiation and screened. BMP signal inhibitor (Dorsomorphin), p38MAPK (SB203580) signal inhibitor, activator WNT (BIO) signal, and WNT signal inhibitor (XAV939, IWR-1, IWP-1, and IWP-3) is, promote myocardial differentiation have been reported (non-patent document 26-32). However, in these processes, even under serum-containing differentiation can only be obtained at a concentration of 10-60% (non-patent document 26-32). Extensive clinical applications, a more efficient differentiation results in a low-molecular compound are required.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
 多能性幹細胞の心筋分化誘導法であって、以下の工程を含む方法:
(1)多能性幹細胞を1以上のWNTシグナル活性化剤を含む培地中で培養する工程、および;
(2)工程(1)で得られた細胞を1以上のWNTシグナル阻害剤を含む培地中で培養する工程。

[請求項2]
 1以上のWNTシグナル阻害剤が、以下の式(I)の化合物またはその塩を含む、請求項1に記載の方法:
 式(I):
[化1]
(省略)
[式中、
 R 1-R 5は、各々独立して、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1~5の直鎖又は分岐アルコキシ基;非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基-NR 12R 13(R 12及びR 13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖または分岐アルキル基である)である、ここでR 1-R 5のうち隣接する2つが一緒になって-O-CH 2-O-または-O-(CH 22-O-を形成していてもよい、
 R 6-R 9は、各々独立して、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1~5の直鎖又は分岐アルコキシ基;基-C(O)Aで置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルコキシ基(Aは、非置換又は炭素数1~5の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和5または6員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される1または2個の原子を含んでいてもよい);非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基-NR 12R 13(R 12及びR 13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖または分岐アルキル基である)である、ここでR 6-R 9のうち隣接する2つが一緒になって-O-CH 2-O-または-O-(CH 22-O-を形成していてもよい、
 R 10-R 11は、各々独立して、水素原子;又は炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基である、
 Xは、-CR 14(R 14は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1~5の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基である);酸素原子;硫黄原子;セレン原子;又は基-NR 15(R 15は、水素原子、炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数1~5の直鎖又は分岐アシル基である)である、および
 nは、0から6の整数である]。

[請求項3]
 1以上のWNTシグナル阻害剤が、以下からなる群から選択される化合物またはその塩を含む、請求項2に記載の方法:
 KY02111
[化2]
(省略)
 KY01041
[化3]
(省略)
 T61164
[化4]
(省略)
 KY02114
[化5]
(省略)
 KY01045
[化6]
(省略)
 KY01040
[化7]

 KY02109
[化8]
(省略)
 KY01042
[化9]
(省略)
 KY01043
[化10]
(省略)
 KY01046
[化11]
(省略)
 PB2852
[化12]
(省略)
 N11474
[化13]
(省略)
 PB2572
[化14]
(省略)
 PB2570
[化15]
(省略)
 KY02104
[化16]
(省略)br>
 SO087
[化17]
(省略)
 SO102
[化18]
(省略)
 SO096
[化19]
(省略)
 SO094
[化20]
(省略)


[請求項4]
 1以上のWNTシグナル阻害剤が、以下の化合物またはその塩を含む、請求項3に記載の方法:
 KY02111
[化21]
(省略)


[請求項5]
 1以上のWNTシグナル阻害剤が、XAV939およびIWP-2からなる群から選択されるWNTシグナル阻害剤を含む、請求項1~4のいずれかに記載の方法。

[請求項6]
 1以上のWNTシグナル活性化剤が、GSK3β阻害剤を含む、請求項1~5のいずれかに記載の方法。

[請求項7]
 1以上のWNTシグナル活性化剤が、BIOおよびCHIR99021からなる群から選択されるWNTシグナル活性化剤を含む、請求項6記載の方法。

[請求項8]
 工程(1)および(2)における培地が血清を含まない、請求項1~7のいずれかに記載の方法。

[請求項9]
 工程(1)および(2)における培地がサイトカインを含まない、請求項1~8のいずれかに記載の方法。

[請求項10]
 工程(1)および(2)における培地がアルブミンを含む、請求項1~9のいずれかに記載の方法。

[請求項11]
 工程(1)および(2)における培地がアルブミン以外のタンパク質を含まない、請求項10に記載の方法。

[請求項12]
 工程(1)および(2)が異種成分非存在下で行われる、請求項1~11のいずれかに記載の方法。

[請求項13]
 多能性幹細胞がサルまたはヒト多能性幹細胞である、請求項1~12のいずれかに記載の方法。

[請求項14]
 心筋細胞の製造方法である、請求項1~13のいずれかに記載の方法。

[請求項15]
 1以上のWNTシグナル活性化剤および/または1以上のWNTシグナル阻害剤を含む心筋分化促進用キットであって、請求項1~14のいずれかに記載の方法に使用されるキット。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • KYOTO UNIVERSITY
  • Inventor
  • NAKATSUJI, Norio
  • MINAMI, Itsunari
  • UESUGI, Motonari
  • AIBA, Kazuhiro
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG
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