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FLUOROGENIC NUCLEIC ACID MOLECULE AND TARGET-RNA FLUORESCENT LABELING METHOD

Foreign code F200010216
File No. AF46-02WO
Posted date Aug 4, 2020
Country WIPO
International application number 2019JP047228
International publication number WO 2020116446
Date of international filing Dec 3, 2019
Date of international publication Jun 11, 2020
Priority data
  • P2018-226743 (Dec 3, 2018) JP
Title FLUOROGENIC NUCLEIC ACID MOLECULE AND TARGET-RNA FLUORESCENT LABELING METHOD
Abstract The present invention provides: a fluorogenic RNA capable of visualizing mRNA in the cell, in particular, in a living cell of a mammal; and a target-RNA fluorescent labeling method utilizing the same. The present invention provides a fluorogenic nucleic acid molecule characterized in that: a base sequence in which two or more fluorescent-molecule binding regions are linked via a linker sequence is contained; and the fluorescent-molecule binding regions each have one or more fluorescent-molecule binding aptamer sequences inserted into a scaffold sequence.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Gene expression level of mRNA which is controlled for a better understanding, a space-time kinetics of the mRNA in living cells the establishment of a method to visualize is strongly demanded. Visualization of mRNA in living cells of a general method is used, the target mRNA, such as MS2 or PP713 RNA stem, loop tag is added, and the fluorescent molecule is a method to recruit the fusion protein. The art, in the cytoplasm or track the motion of the mRNA (for example, see Non-Patent Document 1.), The proteins in the nucleus in order to visualize mRNA (for example, see Non-Patent Document 2.), Are applied. However, for the tag in addition to mRNA, mRNA in a cell or to visualize the dynamics of the distribution, when the level of expression, often, a high background of unbound fluorescence protein, interpretation of the results difficult.
MRNA in living cells as a method of visualization, a particular target molecule binds to the nucleotide sequence-dependent RNA aptamer is mentioned as a candidate method. RNA aptamers are of certain, low-molecular-weight compound that binds the fluorescent and the fluorescence can be enhanced by (for example, see Non-Patent Document 3 and 4.). RNA aptamers such as, fluorogenic RNA(fluorogenic RNA) are also referred. Fluorogenic RNA may include, for example fluorophores, GFP(Green fluorescent protein) DFHBI that are analogs of the family of low molecular weight (3,5-hydroxy benzylidene imidazolinone difluoro-4-) and the fluorescent molecule of the binding and Broccoli Spinach, and derivatives thereof (for example, Non-Patent Document 5, Patent Document 1 the reference.).
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
 2以上の蛍光分子結合領域がリンカー配列を介して連結されている塩基配列を含み、
 前記蛍光分子結合領域は、足場配列中に1以上の蛍光分子結合アプタマー配列が挿入されていることを特徴とする、蛍光発生核酸分子。

[請求項2]
 前記リンカー配列の長さが20塩基以上である、請求項1に記載の蛍光発生核酸分子。

[請求項3]
 前記リンカー配列が、特定の立体構造を形成していない、請求項1又は2に記載の蛍光発生核酸分子。

[請求項4]
 前記蛍光分子結合領域は、前記足場配列中に2以上の前記蛍光分子結合アプタマー配列が挿入されている、請求項1~3のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。

[請求項5]
 前記蛍光分子結合領域が、2以上のループ構造を含有するステム・ループ構造を形成する1本鎖核酸分子のうちの少なくとも2の前記ループ構造が、前記蛍光分子結合アプタマー配列に置換されている構造からなる、請求項4に記載の蛍光発生核酸分子。

[請求項6]
 前記蛍光分子結合アプタマー配列が、G-quadruplex構造で挟まれているステム・ループ構造を形成する1本鎖核酸分子の塩基配列を含有しており、
 前記ステム・ループ構造が、4~6塩基のステム構造と4塩基のループ構造からなる、請求項1~5のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。

[請求項7]
 前記蛍光分子結合アプタマー配列が、Broccoli、Broccoli3、又はdBroccoliである、請求項1~6のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。

[請求項8]
 前記蛍光分子結合領域が、配列番号16又は17で表される塩基配列からなる、請求項1~5のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。

[請求項9]
 前記リンカー配列が、配列番号18~20のいずれかで表される塩基配列からなる、請求項1~8のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。

[請求項10]
 前記蛍光分子結合アプタマー配列を4以上含有する、請求項1~9のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。

[請求項11]
 前記蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子が、DFHBIファミリーの蛍光分子である、請求項1~10のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。

[請求項12]
 標的RNAを蛍光標識する方法であって、
 標的RNAに、請求項1~11のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子を直接又は間接的に連結させた後、前記蛍光発生核酸分子中の前記蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子と接触させる、標的RNAの蛍光標識方法。

[請求項13]
 前記標的RNAが、標的遺伝子の転写産物であり、
 前記標的遺伝子の3’非翻訳領域に、前記蛍光発生核酸分子をコードする塩基配列を組み込んだ細胞の細胞内に、前記蛍光発生核酸分子中の前記蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子を導入し、前記標的遺伝子の転写産物と前記蛍光分子とを結合させる、請求項12に記載の標的RNAの蛍光標識方法。

[請求項14]
 標的RNAを蛍光標識する方法であって、
 標的RNAを含有する試料に、前記標的RNAの一部分とハイブリダイズするプローブを請求項1~11のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子に直接又は間接的に連結させた核酸分子と、前記核酸分子中の前記蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子とを混合する、標的RNAの蛍光標識方法。

[請求項15]
 外来遺伝子の発現を制御するプロモーターと、
 前記プロモーターの下流にあり、前記外来遺伝子のコーディング領域を挿入するための制限酵素部位と、
 前記制限酵素部位の下流に3’非翻訳領域と、を有しており、
 前記3’非翻訳領域が、請求項1~11のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子をコードする塩基配列を含む、ベクター。

[請求項16]
 足場配列中に1以上の蛍光分子結合アプタマー配列が挿入されている蛍光分子結合領域が2以上、リンカー配列を介して連結されている塩基配列を含む蛍光発生核酸分子における前記リンカー配列を設計する方法であって、
 1の前記蛍光分子結合領域の上流及び下流に候補リンカー配列を連結したRNA配列を評価用RNA配列とし、
 前記評価用RNA配列中の前記蛍光分子結合領域の立体構造の予測結果が、前記蛍光分子結合領域のみからなるRNA配列の立体構造の予測結果と同一であり、かつ、前記候補リンカー配列部分が立体構造をとらないと予測されるように、前記リンカー配列を設計する、リンカー配列の設計方法。

[請求項17]
 前記候補リンカー配列が、制限酵素部位にランダムなRNA配列が付加された配列である、請求項16に記載のリンカー配列の設計方法。

[請求項18]
 前記候補リンカー配列の長さが、20塩基以上80塩基以下である、請求項16又は17に記載のリンカー配列の設計方法。

[請求項19]
 請求項11に記載の蛍光発生核酸分子に、DFHBIファミリーの蛍光分子を結合させた後、前記DFHBIファミリーの蛍光分子の励起光を一定時間連続照射し、照射開始時点の蛍光シグナルの輝度値から照射終了時点の蛍光シグナルの輝度値を差し引いた輝度値を、前記蛍光発生核酸分子と結合している前記DFHBIファミリーの蛍光分子から発される蛍光シグナルとして検出する、蛍光発生核酸分子と結合している蛍光分子から発される蛍光シグナルの検出方法。

[請求項20]
 前記DFHBIファミリーの蛍光分子と結合した前記蛍光発生核酸分子に、前記励起光を、一定時間連続照射した後に一定時間照射を中断する照射サイクルで、複数回繰り返し照射し、
 前記照射サイクルごとに、連続照射時の照射開始時点の蛍光シグナルと照射終了時点の蛍光シグナルを検出し、
 全照射サイクルで検出された連続照射時の照射開始時点の蛍光シグナルの輝度値を平均化し、
 全照射サイクルで検出された連続照射時の照射終了時点の蛍光シグナルの輝度値を平均化し、
 平均化された照射開始時点の蛍光シグナルの輝度値から、平均化された照射終了時点の蛍光シグナルの輝度値を差し引いたものを、前記蛍光発生核酸分子と結合した前記DFHBIファミリーの蛍光分子の蛍光シグナルとして検出する、請求項19に記載の蛍光発生核酸分子と結合している蛍光分子から発される蛍光シグナルの検出方法。

[請求項21]
 請求項1~11のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子と、前記蛍光発生核酸分子中の前記蛍光分子結合アプタマー配列と結合する蛍光分子との結合を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
 前記蛍光発生核酸分子と前記蛍光分子とが存在している反応系に、阻害物質の候補物質を共存させて、前記蛍光分子が発する蛍光シグナルを測定し、得られた輝度値が、前記候補物質非存在下において前記蛍光発生核酸分子と結合した前記蛍光分子が発する蛍光シグナルの輝度値よりも小さい場合に、前記候補物質を、前記阻害物質として選抜する、スクリーニング方法。

[請求項22]
 前記蛍光発生核酸分子中の蛍光分子結合アプタマー配列が、G-quadruplex構造で挟まれているステム・ループ構造を形成する1本鎖核酸分子の塩基配列であり、
 前記蛍光分子がDFHBIファミリーの蛍光分子であり、
 前記阻害物質が、G-quadruplex構造をほどき戻す活性を有している、請求項21に記載のスクリーニング方法。

[請求項23]
 前記蛍光発生核酸分子と前記候補タンパク質を共発現させた細胞に、前記蛍光分子を導入して蛍光シグナルを測定し、得られた輝度値が、前記蛍光発生核酸分子のみを発現させた細胞に前記蛍光分子を導入して得られた蛍光シグナルよりも小さい場合に、前記候補タンパク質を、G-quadruplex構造をほどき戻す活性を有する物質として選抜する、請求項22に記載のスクリーニング方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY
  • Inventor
  • OKADA Yasushi
  • ARIYOSHI Tetsuro
IPC(International Patent Classification)
Reference ( R and D project ) CREST Innovative Technology Platforms for Integrated Single Cell Analysis AREA
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