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METHOD FOR PRODUCING OSTEOBLAST CLUSTER USING IPS CELLS

Foreign code F200010231
File No. (S2019-0268-N0)
Posted date Oct 29, 2020
Country WIPO
International application number 2020JP007876
International publication number WO2020175592
Date of international filing Feb 26, 2020
Date of international publication Sep 3, 2020
Priority data
  • P2019-033277 (Feb 26, 2019) JP
Title METHOD FOR PRODUCING OSTEOBLAST CLUSTER USING IPS CELLS
Abstract A method for producing an osteoblast cluster from iPS cells, said method comprising: (1) a step for inducing the formation of embryoid bodies by non-adhesively culturing undifferentiated iPS cells; (2) a step for inducing the differentiation of the iPS cells into mesodermal cells by non-adhesively culturing the embryoid bodies of the iPS cells obtained in step (1); and (3) a step for inducing the differentiation into osteoblasts by non-adhesively culturing the mesodermal cells of the iPS cells obtained in step (2), wherein the aforesaid steps (1) and (2) are carried out using a culture container which is provided with a bottom face and a circular side wall standing from the bottom face and in which a plurality of concave portions are formed in the bottom face in such a manner as to be independent from each other.
Outline of related art and contending technology Background Art
The demand for artificial bone/bone prosthetic materials for supplementing bone tumor extraction, crushed bone fracture, bone defects associated with fixation of rheumatoid arthritis, bone defects lost due to maxilla resorption, etc., has been very increasing.
At present, non-resorbable materials such as hydroxyapatite and resorbable materials such as / S-3-th calcium phosphate, which are currently used as artificial bone/bone prosthetic materials in clinical use, have problems such as lack of osteoinductive properties compared to autologous bone, and thus have not always good prognosis of surgical procedures. A hybrid artificial bone obtained by combining a human e bone desired to be developed and promoted as a next generation type with a growth factor protein such as BMP (B o n e Mo r p h o g e n e t i c P r o t e i n) is also provided. Since the bone prosthetic material has no "extracellular matrix" important for bone tissue regeneration, sufficient bone regeneration effect cannot be obtained.
Under such circumstances, the inventors succeed in producing a bone regeneration agent using stem cells as a raw material, comprising inactivated cell clusters, wherein the inactivated cell clusters comprise at least calcified products and extracellular matrix.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
(1)未分化iPS細胞を非接着培養して、胚様体の形成を誘導する工程、
(2)上記工程(1)で得られたiPS細胞の胚様体を非接着培養して、iPS細胞の中胚葉系細胞への分化を誘導する工程、及び
(3)上記工程(2)で得られたiPS細胞の中胚葉系細胞を非接着培養して、骨芽細胞への分化を誘導する工程
を含むiPS細胞から骨芽細胞塊を製造する方法であって、
該工程(1)及び(2)が、底面と該底面から立設された環状の側壁とを備え、該底面が、互いに独立して設けられた複数の凹部を有する培養容器を用いて行われる、方法。

[請求項2]
前記複数の凹部の少なくとも1個における円相当直径が200~900μmでありかつ深さが200~1000μmである、請求項1に記載の方法。

[請求項3]
前記複数の凹部の開口部の形状が略円形である、請求項1に記載の方法。

[請求項4]
前記iPS細胞がヒトiPS細胞又はマウスiPS細胞である、請求項1に記載の方法。

[請求項5]
前記工程(1)における培養時間が0.625~3.5日間である、請求項4に記載の方法。

[請求項6]
前記工程(2)における培養が、Wntシグナル活性化剤及びヘッジホッグシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも一種の存在下で行われる、請求項1に記載の方法。

[請求項7]
前記Wntシグナル活性化剤が、CHIR99021、6-ブロモインディルビン-3’-オキシム、ケンパウロン、SB-216763、SKL2001、デオキシコール酸、WAY-316606、NSC-693868、リシニン、7-oxo-β-シトステロール、IM-12、HLY78、及びレチノイン酸からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項6に記載の方法。

[請求項8]
前記ヘッジホッグシグナル阻害剤が、シクロパミン、AY9944、GANT58、GANT61、ジェルビン、SANT-1、SANT-2、U18666A、ベラトラミン、ビスモデギブ、Cur-61414、ロボトニキニン、JK184及びHPI-4からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項6に記載の方法。

[請求項9]
前記工程(3)における培養が、低酸素模倣化合物及びスタチン化合物からなる群より選択される少なくとも一種の存在下で行われる、請求項1に記載の方法。

[請求項10]
前記工程(1)の前に、フィーダー細胞を用いずに未分化iPS細胞を培養する工程を含む、請求項1に記載の方法。

[請求項11]
前記工程(1)が、細胞濃度1.5×10 5~3.5×10 5 cells/mlの未分化iPS細胞の懸濁液を培養容器に配置し、培養することにより行われる、請求項10に記載の方法。

[請求項12]
前記工程(2)が少なくとも1個のウェルを有する培養容器を用いて行われ、かつ工程(3)が、前記工程(2)で得られた中胚葉系細胞を含む1~10ウェル分の培養液を培養容器に配置し、培養することにより行われる、請求項11に記載の方法。

[請求項13]
 前記工程(1)における培養がROCK阻害剤の存在下で行われ、前記工程(2)及び工程(3)における培養がレチノイン酸の存在下で行われる、請求項1に記載の方法。

[請求項14]
請求項1に記載の方法により得られる骨芽細胞塊であって、ヒトiPS細胞由来の骨芽細胞塊であり、フェレット径が1~4mmである、細胞塊。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • TOHOKU UNIVERSITY
  • Inventor
  • EGUSA, Hiroshi
  • OKAWA, Hiroko
  • HORIE, Naohiro
  • KONDO, Takeru
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN WS ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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