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PREPARATION AND EXPANSION CULTURE OF ENDOTHELIAL PROGENITOR CELL

Foreign code F200010250
File No. (S2019-0238-N0)
Posted date Oct 30, 2020
Country WIPO
International application number 2020JP005255
International publication number WO2020179380
Date of international filing Feb 12, 2020
Date of international publication Sep 10, 2020
Priority data
  • P2019-040117 (Mar 6, 2019) JP
Title PREPARATION AND EXPANSION CULTURE OF ENDOTHELIAL PROGENITOR CELL
Abstract The present invention addresses the problem of providing a means for easily preparing endothelial progenitor cells at high purity and low cost. The present invention also addresses the problem of providing a method for efficiently proliferating endothelial progenitor cells. Endothelial progenitor cells are prepared at high purity by the steps of: differentiating pluripotent stem cells into endothelial progenitor cells; and purifying the endothelial progenitor cells using the difference in adhesion ability between the endothelial progenitor cells of the cell population obtained in the previous step and other cells. Meanwhile, the endothelial progenitor cells are cultured and proliferated in the presence of a ROCK inhibitor, a GSK-3β inhibitor, and a TGF-β receptor inhibitor as well as a basic fibroblast growth factor and an epidermal growth factor.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Human pluripotent stem cells including induced pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells , iPS cells) and embryonic stem cells (embryonic stem cells , ES cells) proliferate infinitely and have the ability to differentiate into any site of the human body. Because of this characteristic, human pluripotent stem cells (, particularly iPS cells), are expected to be used for the construction of drug screening models simulating human organs and clinical applications in regenerative medicine.
Various clinical applications of the iPS cell-derived vascular endothelial progenitor cells (EPCs) may be considered, such as blood vessel regeneration, myocardial infarction treatment by co-transplantation with myocardium, and three-dimensional cellular tissue construction of advanced organs. In addition, it is expected to construct a pathological model of vascular diseases and to use it as a screening system in developing new drugs by differentiating it into brain capillary endothelial cells. A large amount of high-purity vascular endothelial progenitor cells are required to be used for such purposes.
Reference) is now made to (, for example, Non-Patent Documents 1 and 2, where many reports have been made that vascular endothelial cells (ECs) and vascular endothelial progenitor cells are efficiently differentiated and induced from ES and iPS cells. However, since the rate of differentiation into vascular endothelial cells and vascular endothelial progenitor cells is greatly affected by the cell line used and the state before differentiation, it is often purified by using antibody beads/magnetic beads or cell sorter in order to obtain high-purity cells. In addition, efficient expansion culture of iPS cell-derived vascular endothelial progenitor cells has been reported. The research group of the present inventors reported a novel method for inducing differentiation of vascular endothelial progenitor cells by applying iPS-sac method in the previous patent application (Patent Document 1). Patent Document 2 discloses a method for preparing vascular endothelial progenitor cells from embryonic stem cells.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
 以下の工程(1)及び(2)を含む、血管内皮前駆細胞の調製方法:
 (1)多能性幹細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程;
 (2)工程(1)で得られた細胞集団を構成する血管内皮前駆細胞とその他の細胞の接着能力の差を利用して血管内皮前駆細胞を純化する工程。

[請求項2]
 工程(2)が以下の工程(2-1)及び(2-2)からなる、請求項1に記載の調製方法:
 (2-1)第1細胞解離液を用いた第1剥離処理により前記その他の細胞を培養面から剥離し、除去する工程、
 (2-2)第2細胞解離液を用いた剥離処理であって、前記第1剥離処理よりも細胞剥離効果が高い第2剥離処理により前記血管内皮前駆細胞を培養面から剥離し、回収する工程。

[請求項3]
 前記第1剥離処理と前記第2剥離処理が、以下の(a)~(d)の中の一以上の条件を満たす、請求項2に記載の調製方法:
 (a)第1剥離処理よりも第2剥離処理の方が処理時間が長い、
 (b)第1剥離処理よりも第2剥離処理の方が処理温度が高い、
 (c)第1剥離処理に用いる第1細胞解離液よりも第2剥離処理に用いる第2細胞解離液の方が有効成分濃度が高い、
 (d)第1剥離処理に用いる第1細胞解離液よりも第2剥離処理に用いる第2細胞解離液の方が有効成分の作用が強い。

[請求項4]
 前記第1剥離処理が、工程(1)で得られた細胞集団の前記第1細胞解離液への接触とそれに続くタッピング処理を含む、請求項2又は3に記載の調製方法。

[請求項5]
 工程(1)が以下の工程(1-1)及び(1-2)からなる、請求項1~4のいずれか一項に記載の調製方法:
 (1-1)多能性幹細胞を中胚葉へと分化させる工程;
 (1-2)工程(1-1)で得られた細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程。

[請求項6]
 工程(1-2)における培養期間が2日間~14日間である、請求項5に記載の調製方法。

[請求項7]
 工程(1-2)の途中で、細胞接着性の強い培養面から細胞接着性の弱い培養面へ切り替える、請求項5又は6に記載の調製方法。

[請求項8]
 工程(1-2)が、以下の培養工程(1-2-1)と(1-2-2)を含む、請求項5又は6に記載の調製方法。:
 (1-2-1)骨形成因子4及び血管内皮増殖因子の存在下での培養、
 (1-2-2)塩基性線維芽細胞増殖因子及び血管内皮増殖因子の存在下での培養。

[請求項9]
 工程(1-2-1)の培養期間が1日間~7日間であり、工程(1-2-2)の培養期間が1日間~7日間である、請求項8に記載の調製方法。

[請求項10]
 工程(1-2-1)の培養に細胞接着性の強い培養面を用い、
 工程(1-2-2)の培養に細胞接着性の弱い培養面を用いる、請求項9に記載の調製方法。

[請求項11]
 細胞接着性の強い前記培養面が基底膜成分又はその断片を表面にコートした培養面であり、細胞接着性の弱い前記培養面がゼラチン、ポリ-D-リジン及びポリ-L-リジンからなる群より選択される材料を表面にコートした培養面である、請求項7又は10に記載の調製方法。

[請求項12]
 異種動物由来成分を含まない条件下で全ての工程が行われる、請求項1~11のいずれか一項に記載の調製方法。

[請求項13]
 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項1~12のいずれか一項に記載の調製方法。

[請求項14]
 人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項13に記載の調製方法。

[請求項15]
 請求項1~14のいずれか一項に記載の調製方法で得られた血管内皮前駆細胞。

[請求項16]
 純度が90%以上である、請求項15に記載の血管内皮前駆細胞。

[請求項17]
 請求項15又は16に記載の血管内皮前駆細胞を含む、細胞製剤。

[請求項18]
 請求項15又は16に記載の血管内皮前駆細胞の、in vitroでの血管の構築又はヒト血液脳関門モデルの構築への使用。

[請求項19]
 血管内皮前駆細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子と上皮成長因子に加え、ROCK阻害剤、GSK-3β阻害剤及びTGF-β受容体阻害剤の存在下で培養する工程を含む、血管内皮前駆細胞の拡大培養法。

[請求項20]
 ROCK阻害剤がY-27632であり、GSK-3β阻害剤がCHIR 99021であり、TGF-β受容体阻害剤がA 83-01である、請求項19に記載の拡大培養法。

[請求項21]
 前記血管内皮前駆細胞が、多能性幹細胞を分化誘導して得られた細胞である、請求項19又は20に記載の拡大培養法。

[請求項22]
 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項21に記載の拡大培養法。

[請求項23]
 人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項22に記載の拡大培養法。

[請求項24]
 前記血管内皮前駆細胞が請求項1~14のいずれか一項に記載の調製方法で調製された細胞である、請求項19又は20に記載の拡大培養法。

[請求項25]
 前記血管内皮前駆細胞が、生体から事前に採取された血管内皮前駆細胞又はそれを生体外で維持又は増殖させた細胞である、請求項19又は20に記載の拡大培養法。

[請求項26]
 異種動物由来成分を含まない条件下で前記工程が行われる、請求項19~25のいずれか一項に記載の拡大培養法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NAGOYA CITY UNIVERSITY
  • Inventor
  • MATSUNAGA Tamihide
  • HASHITA Tadahiro
  • AOKI Hiromasa
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN WS ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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